Hippo信號通路相關分子與腫瘤發生的研究進展

齊海霞，柴艷芬

(天津醫科大學總醫院急診醫學科，天津 300041)

Hippo信號通路最早是在果蠅中發現的，在果蠅中Hippo信號通路的主要功能是調節組織器官體積大小[1]。Hippo信號通路在各種哺乳動物中均存在且高度保守，在細胞生理生長和再生過程中存在多種調控細胞增殖的機制[2]。這些控制機制中的一種或多種失效可能導致細胞分裂失控，最終導致癌癥的發展。有證據表明，Hippo信號通路在不依賴于器官大小控制的增殖控制中也發揮重要作用[3]，特別是Hippo信號通路中的核心效應蛋白參與多種調控細胞增殖及凋亡的信號通路[4]。在癌細胞中，Hippo信號通路通過參與細胞分裂的控制而調節細胞增殖凋亡平衡，從而調控器官體積[5]。Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)作為Hippo信號通路中的重要分子，在人類惡性腫瘤中廣泛激活，許多與癌癥相關的外在和內在因素共同激活了正常組織中抑制YAP的微環境，包括機械轉導、炎癥、致癌信號和上游信號分子的變化[6-7]；Hippo信號通路的激活可誘導細胞異常增殖，且與多種病理狀態有關。研究表明，Hippo信號通路中上游調節分子及核心分子的失活可導致腫瘤的發生[8]。現就Hippo信號通路相關分子與腫瘤發生的研究進展予以綜述。

1 Hippo信號通路

Hippo信號通路由上游調節分子、核心分子、下游效應分子3部分組成(圖1)。哺乳動物核心激酶組分包括哺乳動物STE20樣蘇氨酸激酶(mammalian STE20-like protein kinase，MST)1和MST2、含WW結構域的人同源重組蛋白1(salvador homology 1，SAV1)、大抑癌絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(large tumor suppressor serine/threonine protein kinases，LATS)1和LATS2以及重組人MOB激酶激活因子(MOB kinase activator，MOB)1A和MOB1B。轉錄共激活因子YAP和含有PDZ結合位點轉錄共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ)是Hippo通路的下游效應因子，調控靶基因表達。在調節通路中，核心激酶組分中MST和LATS發揮抑制細胞過度增殖的作用，屬于抑癌基因[9]，而其下游效應因子能夠促進細胞的過度增殖、抑制細胞凋亡，屬于促癌基因[10]。細胞分裂的控制對于細胞的正常發育和維持細胞內環境的穩定至關重要。細胞異常增殖與多種病理狀態有關，包括癌癥。雖然Hippo/YAP信號通路最初被認為是控制器官大小和生長的，但越來越多的證據表明，該通路在不依賴于器官大小控制的增殖控制中也發揮重要作用[2-3]。Hippo信號通路的主干由一個激酶級聯組成，該激酶級聯的作用是控制下游效應因子YAP的活性。Hippo信號通路的上游激酶MST1/MST2與適配器蛋白SAV1/WW45(45 kD WW domain protein)協同磷酸化并激活LATS1/2；活化的LATS激酶與MOB1共同磷酸化YAP和TAZ效應蛋白；這一磷酸化事件導致14-3-3蛋白介導的YAP/TAZ核排斥，最終導致YAP和TAZ細胞質降解[11]。然而，YAP和TAZ的主要功能可以歸因于它們的非磷酸化核狀態，在核狀態下，蛋白質作為轉錄輔助因子發揮作用，可以與多個轉錄因子相互作用，YAP/TAZ的主要轉錄結合伙伴是含TEA結構域(TEA domain，TEAD)轉錄因子家族成員(TEAD1-4)，該家族被認為可介導YAP和TAZ的大多數促增殖和致癌功能[12]。

1.1上游調節分子 近來研究發現，含WW結構域蛋白1、神經纖維瘤蛋白2(neurofibroma protein 2，NF2)、非典型鈣黏素Dachs和Fat已確定為Hippo信號Willin:含有FERM結構域的蛋白；Merlin:moesin-ezrin-radixin-like protein；GPCR:G蛋白偶聯受體；PKA:蛋白激酶A；TAOKS:TAO激酶；P:磷酸化；SAV1:含WW結構域的人同源重組蛋白1；MST1/2:哺乳動物STE20樣蘇氨酸激酶1/2；LATS1/2:大抑癌絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1/2；MOB1:重組人MOB激酶激活因子1B；YAP:Yes相關蛋白；TAZ:含有PDZ結合位點轉錄共激活因子；CYR61:富含半胱氨酸 61；NAIP:神經元凋亡抑制蛋白；MCL1:髓樣白血病1；BIRC2/5/7:重組人生存素2/5/7；Nucleus:細胞核；TEAD:含TEA結構域通路的重要上游信號調節分子[13]。在動物實驗中，特異性敲除NF2蛋白，小鼠發生肝癌的概率顯著增加，這也確定了上游信號分子NF2發揮抑癌作用[14]。除NF2外，Hippo通路基因的直接基因突變并不十分頻繁，這種獨特的NF2突變模式可能表明，NF2功能的喪失除了使Hippo信號失活外，還會導致其他致癌效應[15]。研究發現，G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)被確定為Hippo信號通路的調節因子[16]。GPCRs作為膜受體被激活后，與外部配體的結合從而激活alpha-subunit 4個子類的一個或多個G蛋白質，從而激活Hippo通路，調控細胞信號轉錄[17]。除了受體介導的調控外，Hippo信號通路還接受來自細胞表面和細胞內部的多種機械輸入，參與Hippo信號調控的機械線索包括與細胞間連接(如緊密連接和黏附連接)結合的蛋白質，以及細胞骨架的組成部分(包括絲狀肌動蛋白、微管、肌動球蛋白，可能還有中心體)，特別是Hippo信號通路蛋白MST與中心體的相互作用能調控細胞周期進展，而這些細胞骨架蛋白也影響Hippo信號通路中YAP的表達[18]。

圖1 Hippo信號通路蛋白

1.2核心分子 核心分子主要成分包括MST1/2、LATS1/2、SAV1和MOB。研究表明，MST1/2、LATS1/2、SAV1和MOB的主要作用機制是通過磷酸化及去磷酸化參與調節。在人類Hippo信號通路中，核心激酶鏈的核心激酶主要作用于胚胎發育和組織內穩態的控制。YAP缺陷小鼠胚胎在出生8 h死亡，且伴有多種發育缺陷，敲除MST1/2或SAV1可導致肝臟過度生長和肝癌的發生，在過表達YAP的轉基因小鼠中也可觀察到這種表型[10]。Hippo信號通路的上游調控因子頂端膜蛋白NF2/Merlin是一種在許多癌癥中被廣泛描述的失活的腫瘤抑制因子，在哺乳動物和蒼蠅中，NF2/Merlin可以在多水平與Hippo信號通路相互作用。Merlin直接將LATS激酶結合定位到細胞膜上，通過MST1/2和SAV1促進其磷酸化和活化；另外一個直接調控LATS活性的機制是通過磷酸化的Merlin介導，磷酸化的Merlin抑制細胞核中E3泛素連接酶CRL4-DCAF1的致瘤作用，即CRL4-DCAF1與Merlin結合，不能泛素化和滅活LATS1/2，從而增強YAP的活性[7]。NF2在肝臟和其他組織失活時，腫瘤的發展受到YAP缺失的抑制，這支持了NF2/Merlin通過抑制YAP活性抑制肝細胞增殖的觀點[14]。嚴格控制細胞分裂對維持成人器官和組織的穩態至關重要。在生理生長和再生過程中，存在著多種調控細胞增殖的細胞機制。核心激酶激活可調控細胞的增殖和凋亡。

1.3下游效應分子 YAP/TAZ是Hippo信號通路的下游效應分子[19]。YAP在無磷酸化時在細胞核內發揮作用，作為共轉錄因子與相關轉錄因子結合，啟動下游相關靶基因的轉錄，促進細胞增殖，進而促進器官的生長；在核內，YAP作為轉錄共激活因子而發揮作用，使LATS1/2磷酸化而轉變為磷酸化的LATS1/2，而磷酸化的LATS1/2使YAP/TAZ發生磷酸化，轉變為磷酸化的YAP/TAZ[20]。磷酸化后的YAP/TAZ轉移至細胞核外，被14-3-3蛋白阻滯于細胞質，抑制了YAP相關增殖靶基因的轉錄[21]。研究表明，運用小干擾RNA的干擾技術干擾上游分子MST1/2或LATS1/2的表達可導致YAP/TAZ的磷酸化減少，細胞核向細胞質轉移減少，核內定位增多，從而促進下游增殖相關靶基因的轉錄，抑制凋亡相關靶基因的轉錄，異常調控使得細胞過度增殖，并且細胞正常程序性死亡受到抑制，腫瘤的發生率顯著增加[22]。另有研究發現，在多種腫瘤細胞中可發現YAP的異常表達(表1)[23-29]。

表1 人Hippo信號通路相關分子

DCHS1/2:Dachsous1/2蛋白；FAT:鈣黏蛋白家族；GPCRs：G蛋白偶聯受體；FRMD6:FERM 結構域包含蛋白 6；Willin：含有FERM結構域的蛋白；WWC1：含WW結構域蛋白；NF2：神經纖維瘤蛋白2；MST1/2：哺乳動物STE20樣蘇氨酸激酶1/2；WW45：45 kD WW domain protein；SAV1：含WW結構域的人同源重組蛋白1；LATS1/2:大抑癌絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1/2；MOB1A:重組人MOB激酶激活因子1A；MOB1B:重組人MOB激酶激活因子1B；YAP:Yes相關蛋白；TAZ:含有PDZ結合位點轉錄共激活因子；TEAD:含TEA結構域；SMAD：Smad蛋白家族；RUNX1/2：人Runt相關轉錄因子1/2

2 Hippo通路信號分子在腫瘤中的表達

腫瘤細胞的起源非常復雜，因為它具有闡明正常細胞狀態中固有的生物學機制的潛力，而正常細胞狀態已經被用來驅動致癌細胞狀態。癌癥干細胞是癌癥發生和轉移的關鍵因素，帶有突變基因組的轉擴增細胞去分化并進入干細胞狀態時腫瘤干細胞就會出現，這一模型與癌癥干細胞是腫瘤轉化正常組織干細胞的直接產物的觀點相反[30]。近年來，關于Hippo/YAP途徑的報道逐漸增多。與其他關鍵的癌癥通路相似，Hippo/YAP通路較復雜，協調多種細胞功能，包括細胞增殖、死亡和分化。研究發現Hippo/YAP通路在腫瘤的可塑性及細胞與環境的相互作用中起核心作用[24]。Hippo/YAP通路可能與其他中樞通路功能相似，但這一通路的其他特殊生物學功能還需進一步研究。Hippo/YAP通路能夠感知和介導獨特的細胞外信號，包括影響細胞分裂機械力。Hippo/YAP通路既具有抑癌作用，又具有致癌性。

2.1胃癌 在胃癌和其他胃腸道腫瘤中，Hippo通路的上游成分往往表達減少，MST1/2、LATS1/2下調失去了對YAP/TAZ的抑制作用，因此YAP1/TAZ通過直接與TEAD轉錄因子結合，在轉錄上激活下游靶點，從而進入細胞核發揮致癌作用[15]。YAP作為Hippo通路的核心下游效應因子，在分化差的胃腺癌和轉移性胃病中，細胞質和胞核中的表達均顯著上調，而在早期胃癌中，YAP的激活與不良預后相關，在對YAP基因敲除時，則表現出胃癌細胞抑制性增殖的效果，如細胞增殖減少、細胞侵襲和遷移減少等，在胃癌細胞中微RNA(microRNA，miRNA/miR)-15a、miR-16-1、miR-506等腫瘤抑制因子對YAP發揮負調控作用[31]。轉錄輔助因子退變樣蛋白4是胃癌中具有抑制腫瘤作用的殘留樣蛋白家族成員，通過與YAP競爭結合TEADs破壞YAP-TEADs互相作用，從而抑制胃癌細胞的過度增殖，一種模擬轉錄輔助因子退變樣蛋白4功能的人工肽在體內外均能發揮抑制腫瘤細胞增殖的作用[32]，成為胃癌的一種潛在治療策略。越來越多的證據強調了Hippo信號通路在胃腸道組織穩態中的重要性，而Hippo信號通路去調節則會誘發腫瘤的發生。研究表明，降低YAP的表達可以增加胃癌患者對藥物的敏感性，且顯著減少患者的耐藥性，從而提高患者的生存率[33]。

2.2結腸癌 對大量臨床結腸癌患者的研究發現，Hippo通路在維持正常腸內平衡中起重要作用；信號通路的異常調控導致組織過度生長和腫瘤的發生[16]。特異性條件敲除MST1和MST2的小鼠，腸絨毛結構紊亂，未分化細胞膨脹，在這些實驗鼠的結腸中可見異常增生的上皮細胞和腺瘤；同樣，小腸和大腸缺乏SAV1的小鼠腸隱窩結構增大，息肉形成風險增加100倍，在正常穩態下，腸道中YAP或TAZ蛋白水平缺失沒有明顯的不良表型[34]。反之，Hippo通路組分MST1、MST2和SAV1對于正常組織的穩態必不可少，說明Hippo通路在正常條件下具有穩態活性，可以抑制YAP和TAZ活性。Hippo通路的破壞導致YAP1和TAZ的過度激活，進而導致不受控制的干細胞增殖和腫瘤基因的過度轉錄表達[35]。雖然YAP在正常的腸內平衡過程中作用不顯著，但YAP活性對損傷后的腸再生必不可少。在小鼠中，用硫酸右旋糖酐鈉誘導結腸炎并再生100 d后，YAP蛋白水平升高，體內和體外研究表明，白細胞介素-6受體亞單位β是白細胞介素-6的共同受體，通過Src家族激酶激活YAP，作用于硫酸右旋糖酐鈉誘導的腸絞痛；與野生型小鼠相比，特異性條件敲除YAP的小鼠在遭受硫酸右旋糖酐鈉誘導的腸道損傷100 d后，病死率更高，隱窩室損失更廣泛；全身輻照也被廣泛用于研究小鼠腸道再生，YAP在輻照109 d后被激活，YAP敲除小鼠在輻照誘導損傷后的增殖降低[36]。上述研究表明，YAP通過調節腸上皮細胞增殖正向調節腸道組織再生。構建小鼠(Bcl-2)結腸癌模型發現，小鼠結腸癌細胞中YAP的表達較對照組顯著增加[10]。這也證明了YAP作為Hippo信號通路中的促癌蛋白而發揮作用。近來有研究證明，ω-3多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸通過與細胞膜蛋白GPCR40/GPCR120結合激活Hippo這一通路，使得YAP的磷酸化增加，發生細胞質轉移的量增加，從而降低結腸癌的發生率[22]。在體外實驗中，ω-3多不飽和脂肪酸能顯著抑制結腸癌腫瘤細胞的增殖及促進其凋亡，而體內實驗時，實驗組小鼠腫瘤的發生率降低，腫瘤的生長體積減小[22]，再次證明了YAP作為Hippo通路的核心蛋白在腫瘤的發生及增殖中起重要作用。

2.3肝癌 成體肝細胞基本處于靜止狀態，這些細胞的周轉率為180～400 d，這意味著肝細胞每年分裂1～2次，然而哺乳動物的肝臟具有巨大的再生能力，在肝部分切除術中損失的70%肝組織可以在幾天內通過剩余肝葉的肝細胞增殖恢復；進一步的研究表明，Hippo信號的失活以及YAP表達和活性的增強對肝臟再生過程至關重要，Hippo信號通路的動態變化調控和YAP的激活可能是肝臟內環境穩定和維持正常肝大小的原因[37]。Hippo信號通路是維持分化肝細胞狀態所必需，也決定了肝細胞的生長與凋亡。肝癌是由肝細胞不受控制的增殖導致的，因此在人肝癌和小鼠模型中YAP表達增加支持了YAP可以作為肝細胞增殖的主要驅動因素的觀點。在Hippo信號通路中，上游信號分子及核心分子發揮抑癌作用，有研究構建含有缺失Hippo信號通路蛋白的各種小鼠模型，包括信號通路中的上游信號分子及核心分子MST1、MST2、SAV1、Merlin、LATS1和LATS2，并對這些成分在肝臟大小控制和癌變中的功能進行了研究，發現在肝臟特異性MST1和MST2敲除小鼠中，肝腫大和自發性肝細胞癌的發生率明顯增加；特異性SAV1敲除的小鼠肝臟表現出更復雜的腫瘤發生，并同時表現為肝細胞癌和膽管癌的發生，這也驗證了MST1/2、SAV1發揮抑制肝癌發生的這一觀點。MST1/2與YAP在肝癌的發生中發揮相反的作用，在肝卵圓細胞中，哺乳動物Hippo通路控制增殖速度，從而限制肝臟大小，防止肝細胞癌的發生，MST過表達抑制細胞增殖，促進YAP磷酸化成P-YAP，YAP出細胞核并且下調結締組織生長因子、雙調蛋白呈增殖相關mRNA轉錄，從而不能發揮促癌功能[38]。正常情況下，健康肝臟中不存在卵圓細胞，卵圓細胞作為假定的肝干細胞，損傷后的譜系追蹤研究證實，卵圓細胞可同時產生肝細胞和膽管細胞，在肝臟特異性MST1/2、WW45或NF2敲除小鼠以及YAP轉基因動物中發現卵形細胞過度增殖、肝臟體積增大甚至肝癌的發生，這也驗證了MST1/2與YAP分別發揮抑癌和促癌發生的作用[39]。這些觀察結果表明，卵圓細胞的擴張是由于固有的遺傳缺陷，而不是由于肝細胞損傷或受損的肝再生，而Hippo通路是抑制肝卵圓細胞活化所必需的。研究表明，YAP限制范圍內的表達量能夠發揮有益的作用，可以促進肝細胞及膽管上皮細胞在正常范圍內增殖，迅速更新實質細胞(肝細胞)和非實質細胞(膽管細胞、庫普弗細胞、星狀細胞和竇內皮細胞)，恢復生理功能[40]。YAP在肝細胞癌的發生發展中起著促癌甚至致癌的作用。利用小干擾RNA技術下調YAP可顯著恢復晚期肝細胞癌肝細胞分化，導致腫瘤消退[41]。SIRT1(sirtuin-1)被報道在肝細胞癌細胞中去乙酰化YAP1蛋白，SIRT1介導的去乙酰化增強了YAP1-TEAD4的相互作用，從而激活YAP1/TEAD4的轉錄能力，刺激肝癌細胞無限增殖[42]。研究表明，YAP在乙型肝炎病毒感染的肝癌中表達顯著升高，針對感染乙型肝炎病毒HepG2.2.15肝癌細胞系的實驗表明，乙型肝炎病毒能與YAP啟動子在含有cAMP反應元件結合蛋白-232/+115位點結合，并以cAMP反應元件結合蛋白依賴的方式激活YAP啟動子[43]。

2.4肺癌 成纖維細胞生長因子1型受體(fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1)信號通路是肺癌發生的重要通路。在肺癌的研究中發現，YAP的表達與臨床肺癌樣本中FGFR1的表達呈正相關，YAP影響FGFR1信號通路，以維持肺癌中FGFR1擴增腫瘤干細胞樣細胞的特性；機制上，YAP通過TEAD結合位點上調啟動子水平的FGFR1表達，而FGFR1通過LATS1調控YAP表達；此外，YAP的缺失會破壞肺癌的自我更新能力[44]。這一研究證實了YAP/TAZ能夠促進肺癌細胞的增殖及抑制肺癌細胞的凋亡。p53是目前研究最多的腫瘤抑制因子之一，其編碼基因TP53是人類癌癥中最常見的突變基因，超過50%的腫瘤來自野生型TP53基因序列突變[37]。這些突變事件可能導致p53抑癌功能的喪失或產生具有致癌特性的替代功能蛋白。近年來在非小細胞肺癌的研究中發現，突變p53(TP53)能夠與轉錄輔激活因子YAP和轉錄因子核因子Y在促癌基因(如細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白B、細胞周期依賴性蛋白激酶1)上形成復合物，因此YAP和mutp53不僅可以作為常見致癌靶點的轉錄調控因子而發揮協同作用，并且可以作為治療肺癌的靶點[4]。近年來一個正交異性小鼠模型強調了YAP在肺癌發生和轉移中的作用，維特泊芬是一種YAP抑制劑，能有效抑制YAP和FGFR在肺癌中的表達[45]。因此，認為YAP是一種潛在的肺癌治療靶點，聯合靶向YAP和FGFR1可能對FGFR1擴增肺癌患者有益。

2.5乳腺癌 Hippo/YAP信號通路在乳腺癌發生發展中起重要調控作用，白血病抑制因子受體(leukemia inhibitory factor receptor，LIFR)是一種乳腺癌轉移抑制因子，位于 miR-9下游和Hippo信號上游。在高度惡性腫瘤細胞中恢復LIFR表達可通過觸發Hippo激酶級聯抑制轉移，從而導致磷酸化、細胞質保留和轉錄輔激活因子YAP的功能失活；相反，非轉移性乳腺癌細胞中LIFR的丟失通過激活YAP誘導乳腺癌細胞的遷移、侵襲和轉移定植[46]。LIFR在人類乳腺癌中下調，與轉移呈負相關，在973例非轉移性乳腺腫瘤中，LIFR表達與患者無轉移、無復發和總體生存結局相關[47]。這些發現表明，LIFR是一種通過Hippo/YAP通路發揮作用的轉移抑制因子。YAP/TAZ在胞核內增多，促進乳腺癌細胞的增殖，且YAP/TAZ活性增強增加了腫瘤細胞侵襲性遷移[48]。一項回顧性研究表明，在乳腺侵襲性導管癌中，與雌激素受體、孕酮受體和人表皮生長受體2相比，YAP的表達水平最高，且YAP的表達與人表皮生長受體2及淋巴結轉移相關；多因素Cox回歸分析顯示，YAP表達和孕酮受體狀態分別是乳腺癌患者病死率和總體生存率的獨立有利預測因子[49]。綜上結果表明，YAP是乳腺癌患者的預后指標，能顯著影響患者預后及生存時間。

3 小 結

越來越多的數據強調了Hippo信號在控制增殖方面的重要作用，包括在癌癥中發現的無限制增殖。在Hippo通路中，MST1/2和LATS1/2調控下游轉錄輔激活因子YAP和TAZ，YAP和TAZ可以與幾種不同的轉錄因子結合，每一種均可能啟動轉錄程序，促進活性YAP/TAZ的功能多樣性，促進組織增殖和腫瘤干細胞的自我更新、遷移和癌變。YAP/TAZ是由多個信號通路組成的調控細胞增殖凋亡及組織器官大小復雜網絡的一個組成部分和中心連接點，因此還需關注Hippo通路與其他腫瘤相關通路之間的相互作用，深入了解Hippo通路的調控機制，并探討其作為治療靶點的潛力，對腫瘤的診斷及防治有重要意義。