KIFC3基因在結直腸癌中的表達及預后分析

林佳鈿，謝喜娜

(1.北京大學深圳醫院微創介入科，廣東 深圳 518036；2.深圳大學第一附屬醫院轉化醫學研究院，廣東 深圳 518035；3.汕頭大學醫學院細胞生物學與遺傳學教研室，廣東 汕頭 515041)

結直腸癌作為常見的消化系統腫瘤，其轉移治療效果不佳，機制不明，是臨床亟待解決的重要問題。驅動蛋白超家族分子(kinesin superfamily proteins，KIFs)異常表達可以導致有絲分裂過程中DNA的不平等分布，從而產生異倍體細胞，進而與腫瘤的惡性進展密切相關[1-2]。目前，多種KIFs家族成員已被證實參與結直腸癌、胃癌、肺癌、腎癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、惡性膠質瘤等多種腫瘤的發生發展過程[3-8]。驅動蛋白家族分子C3(kinesin family member C3，KIFC3)屬于KIFs第14亞家族，參與乳腺癌紫杉醇的化療抵抗[9]，并且與肝細胞癌的預后相關[10]。然而，目前KIFC3與結直腸癌發生、發展相關的報道較少見。本研究主要通過腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)和Oncomine數據庫及臨床結直腸癌樣本，比較KIFC3在結直腸癌中的表達以及對生存預后的影響，為進一步闡明KIFC3在腫瘤發生、發展中的作用機制提供參考，也為結直腸癌的早期輔助診斷和預后判斷提供新線索。

1 資料與方法

1.1數據資料收集 通過UCSC Cancer Browser(https://genome-cancer.ucsc.edu)下載TCGA數據庫中結直腸癌組織的RNA表達數據，并提取結直腸癌病例的臨床參數和生存資料(TCGA_COADREAD_exp_HiSeqV2-2015-02-24)。分析TCGA數據庫中50例正常結直腸組織和380例結直腸癌組織KIFC3的表達水平。通過Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org)中Gaedcke結直腸癌[11]和Notterman直腸癌[12]數據集進一步比較KIFC3在結直腸癌組織和結直腸正常組織中的表達水平。

1.2臨床組織標本收集 收集2017年1—6月從汕頭大學醫學院附屬第一醫院收治的19例經結直腸癌手術切除治療的結直腸癌患者，每例標本包括癌組織及癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣≥3 cm)。新鮮組織標本離體后30 min內放入液氮速凍，后轉入-80 ℃ 冰箱保存。納入標準：①所有病例術前未進行過放化療及介入治療；②臨床資料完整；③均經病理學診斷確診為結直腸癌。排除標準：①合并其他腫瘤；②術后1個月內出現嚴重并發癥、復發或死亡。其中男14例、女5例；患者年齡30～86歲，平均(55±18)歲，腫瘤浸潤程度：T1～2期4例，T3～4期15例；發生淋巴結轉移8例，無淋巴結轉移11例；遠處轉移5例，無遠處轉移14例；腫瘤分化程度：低分化13例，高分化6例。本研究獲得汕頭大學醫學院附屬第一醫院倫理委員會批準(批準號：SUMC-2015-42)，患者均簽署知情同意書。

1.3材料 Trizol試劑購自美國英杰公司；反轉錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒購自瑞士羅氏公司；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純；KIFC3及β肌動蛋白(β-actin)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司根據設計合成。

1.4qRT-PCR檢測結直腸癌組織及其癌旁正常組織中KIFC3 mRNA的表達 稱取5 mg組織樣品，用研磨研碎，加入1 mL Trizol，轉移至1.5 mL離心管中；每管加入200 μL氯仿萃取RNA，靜置5 min后用4 ℃離心機12 000×g離心15 min；取出上清液至新的離心管，加入600 μL異丙醇沉淀，10 min后用4 ℃離心機12 000×g離心10 min，棄上清液，用1 mL 70%乙醇清洗RNA沉淀；干燥RNA后用 60 μL 無RNA酶的水溶解RNA，用分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。參照逆轉錄試劑盒實驗操作說明取1 μg總RNA逆轉錄為互補DNA。使用Primerbank數據庫(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)[13]中KIFC3及β-actin的引物序列(KIFC3 上游引物:5′-GCAGATTGCCATGTACGAGTC-3′，下游引物:5′-CGGACGCCTGCTAGATTCTC-3′；β-actin上游引物:5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′，下游引物:5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA -3′)。根據qRT-PCR試劑盒操作說明進行擴增。將2 μL互補DNA、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、10 μL SYBR(Synergy Brands Synergy Brands)混合液和7 μL雙蒸水建立20 μL的反應體系，按“95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個循環”的反應條件進行擴增。反應結束后獲取基因表達的cycle threshold值，以β-actin為內參，用2-ΔCt法[14]計算KIFC3的相對表達量。

2.3KIFC3高表達組與低表達組患者的預后比較 將TCGA數據庫中的數據按照KIFC3表達水平的平均數(8.217 698)進行二等分，其中KIFC3 mRNA表達>8.217 698為KIFC3高表達組，≤8.217 698為低表達組。Kaplan-Meier plotter生存分析顯示,KIFC3表達水平的高低可以影響結直腸癌的總體生存期(P=0.018)，但不影響無病生存期(P=0.093)，KIFC3高表達組的患者總生存期短于KIFC3低表達組，見圖1。單因素Cox回歸分析顯示,年齡、病理分期、遠處轉移、淋巴結轉移和KIFC3水平可以影響患者的總體生存時間(均P<0.05)，見表3；將上述影響因子進行多因素Cox回歸分析，結果顯示除年齡和遠處轉移外，KIFC3的表達水平仍可以影響總體生存期(P<0.05)，即KIFC3 mRNA高表達患者的死亡風險約為低表達的1.8倍。見表4。

試卷以能力立意設計試題，考查了思維能力、運算求解能力、空間想象能力等能力．在此基礎上，特別突出了對數學思維的全面、深刻考查，大量題目考查了觀察、聯想、類比、猜想等數學思維方法與能力，對函數與方程、數形結合、分類與整合、化歸與轉化等數學思想進行了較全面的考查．

2 結 果

2.2結直腸癌患者各項臨床病理特征KIFC3表達水平的比較 運用TCGA數據庫中結直腸癌患者的臨床數據進行分析，結果顯示，不同性別、年齡、是否發生遠處轉移的KIFC3 mRNA比較差異無統計學意義(P>0.05)，發生淋巴結轉移的KIFC3 mRNA水平高于無轉移者，腫瘤浸潤T3～4期的KIFC3 mRNA水平高于腫瘤浸潤T1～2期的患者，病理分期Ⅲ～Ⅳ期的KIFC3 mRNA水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.01)。見表2。

（二）回歸課本，精選習題。教材是知識的載體，不熟悉教材就沒辦法形成知識網絡體系。基礎知識就不能準確、完整把握。所以說復習的最高境界就是將習題與課本有效的統一起來，可以多做點典型例題，在做題的過程中，把課本當成工具書查漏補缺，盡快發現自己哪些知識點的掌握還不到位，有針對性地看書，同時用心體會解題的思路，以提高能力；建議不時的翻翻書，在有限的時間內，如果集中精力把課本上最基本的內容弄清弄活，不致使知識遺忘。在每節課上都要精選習題，在每一次的考試命題中，一定要研究近年來的高考題。不僅研究采點和命題的形式，而且在語言的描述上也要細細揣摩研究命題意圖。

2.1結直腸癌組織和正常組織中KIFC3表達水平比較 TCGA數據庫中，結直腸癌組織KIFC3的表達水平高于正常組織(P<0.01)。Oncomine數據庫Gaedcke和Notterman數據集中，結直腸癌組織KIFC3的表達水平顯著高于正常組織(P<0.01)。進一步通過qRT-PCR技術檢測19例結直腸癌組織及癌旁正常組織中KIFC3的水平，與癌旁正常組織比較，結直腸癌組織中KIFC3的表達顯著升高(P<0.05)。見表1。

結直腸癌是常見的消化系統腫瘤，在惡性腫瘤中排第三位，在因癌癥導致死亡的病因中居第四位。根據《CA Cancer J Clin》癌癥統計數據顯示，2015年中國結直腸癌新發病例約376 300例，死亡率達50%[15]。美國2017年癌癥報告預計，2017年大約新增135 430例結直腸癌患者，死亡率達37.1%[15]。目前根治性手術切除輔以合理的放化療是結直腸癌的主要治療手段，但治療效果并不理想，30%～50%的患者術后出現復發[16]，且生存率不高，發生轉移的患者5年生存率僅有10%～15%[17]。可見，結直腸癌的發病形勢十分嚴峻，但其發病與轉移的分子機制尚不明確，這也一直是制約結直腸癌診療的主要瓶頸。目前，尋找新的高敏感性、準確性和特異性的預后標志物以提高診療效果是結直腸癌早期診治的關鍵。

組別例數KIFC3水平t值P值TCGA數據庫正常組織結直腸癌組織503807.13±0.768.22±1.039.038a<0.001Oncomine數據庫Gaedcke數據集正常組織結直腸癌組織6565-0.53±0.30 0.54±0.5114.524a<0.001Notterman數據集正常組織結直腸癌組織18181.96±0.522.49±0.513.067a0.004臨床收集樣本正常組織結直腸癌組織19192.07±4.933.39±6.262.151b0.045

KIFC3：驅動蛋白家族分子C3；TCGA：腫瘤基因組圖譜；a為獨立樣本t檢驗，b為配對樣本t檢驗

項目例數KIFC3水平t值P值性別男女2051668.21±1.028.22±1.040.0960.924年齡≤65歲>65歲1811908.18±1.048.25±1.020.6680.504遠處轉移否是251498.21±1.038.39±0.881.1800.239淋巴結轉移否是2031648.05±1.058.42±0.973.4730.001腫瘤浸潤T1～2期T3～4期703007.87±1.038.30±1.013.1590.002病理分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期1911678.06±1.078.38±0.952.9290.004

KIFC3：驅動蛋白家族分子C3

KIFC3：驅動蛋白家族分子C3

表3 KIFC3水平和各種臨床因子與總體生存率的單因素Cox回歸分析

KIFC3：驅動蛋白家族分子C3

表4 KIFC3水平和各種臨床因子與總體生存率的多因素Cox回歸分析

KIFC3：驅動蛋白家族分子C3

3 討 論

例3中的“highly likely”不僅表達極大的可能性，還透露出一種積極的主觀上的高度期待，而例4中的“likely”卻表達一種負面的推測，暗示“一帶一路”倡議的一種消極的可能性。這種差異也表現在“基于證據或表象的假定”（evidence/appearance-based postulation）的使用上，例如：

KIFs在真核細胞中廣泛表達，并在細胞分裂和囊泡與細胞器的胞內轉運過程中發揮重要作用[18]。在有絲分裂過程中，KIFs被瞬時合成并與微管結合，直接調節紡錘體和姐妹染色單體的正常分離[19-20]；一旦KIFs出現異常表達，將導致有絲分裂過程中DNA的不平等分布，產生異倍體細胞，進而介導腫瘤的惡性進展[1-2]。研究表明，多種KIFs家族成員參與結直腸癌、胃癌、肺癌、腎癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤的發生發展過程；已有幾個小分子KIFs抑制劑進入癌癥治療的臨床研究[3-6]。KIFs由45個功能各異的成員構成，根據結構不同又可分成14個亞家族[21]。其中，KIFC3屬于KIFs第14亞家族，在結直腸癌中的表達及其臨床意義尚不清楚。鑒于先前已報道的KIFC3與肝細胞癌的預后相關[10]，對KIFC3在結直腸癌中相關機制及臨床意義的深入研究，有助于提高結直腸癌的診治及預測水平。

本研究首先通過TCGA和Oncomine數據庫分析顯示，KIFC3在結直腸癌組織中的表達明顯高于正常結直腸組織，并通過對臨床結直腸癌標本進行檢測驗證了數據庫的分析結果。進一步利用TCGA數據庫中結直腸癌患者的臨床病理資料進行分析，結果顯示KIFC3的表達水平對淋巴結轉移、腫瘤浸潤和病理分期有影響。本研究生存分析表明，KIFC3 的表達影響結直腸癌的總體生存期，KIFC3表達水平越高，結直腸癌患者總生存時間越短。多因素Cox回歸分析校正其他影響因子的作用，發現結直腸癌患者中KIFC3 mRNA高表達的死亡風險約為低表達的1.8倍，提示KIFC3可以作為結直腸癌臨床預后的一個獨立預測因子。本研究結果與KIFC3在肝細胞癌中的研究報道[10]相似，提示KIFC3對腫瘤發生發展的臨床作用及其預后判斷價值可能具有一定的臨床意義，也將KIFC3作為新的治療靶點運用到腫瘤的防治過程提供了依據。

我明白他的意思。之后的日子里，我試圖去忘掉那天看到的一切，但老陳卻對我說起了那起車禍。那個女人，真的死了。當時，她看我那一眼是不是她生命中最后一眼。

綜上所述，在結直腸癌組織中，KIFC3表達水平升高，且可以影響患者的預后，有望作為結直腸癌臨床預后的一個潛在獨立預測因子。對KIFC3的深入研究可進一步揭示其在結直腸癌中的功能及作用機制，為結直腸癌的早期輔助診斷和基因靶向治療提供新思路。