miR-210表達在老年COPD合并缺血性腦卒中患者中的研究

王樂強，徐麗娜，高程鵬，張翼翔，邱立潔

(濰坊市人民醫院 呼吸內科,山東 濰坊）

0 引言

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是呼吸系統最為常見的疾病之一，占所有老年人群發病率10～15%，最終進展為呼吸衰竭和心力衰竭[1]。腦血管疾病已成為威脅全人類健康的首要疾病，具有高發病率、高致殘率和高死亡率特點，其中70～85%為缺血性腦卒中。據統計，我國每年新發老年COPD合并缺血性腦卒中患者約 200～350萬，死亡率約 30～55%[2]。COPD 和缺血性腦卒中均是受遺傳和環境共同作用的多因素、多基因慢性疾病，微小RNAs（miRNAs）在調控疾病的發生和發展中發揮重要作用，可能成為預防和治療疾病的重要靶點。采用基因測序技術檢測COPD患者循環血液中共有70多種miRNAs表達異常，缺血性腦卒中動物模型和在體臨床研究得出，約89個miRNAs表達明顯下調，35個明顯上調，并隨病情進展表現一定的變化趨勢。在眾多的miRNAs中，miR-210表現的最為穩定而顯著。miR-210與多種呼吸系統疾病，包括感染性肺炎、肺纖維化、哮喘、COPD、肺結核和腫瘤等均有密切關系。在缺血性腦卒中動物模型中證實[3]，miR-210在缺血/缺氧條件下，可參與細胞增殖和細胞周期的調控、誘導血管新生、促進神經再生等?；诖?，該研究旨在分析miR-210在老年COPD合并缺血性腦卒中患者中的表達水平，并分析其作為敏感診斷指標的應用價值。

1 對象與方法

1.1 對象資料

連續選擇2016年01月至2018年01月入我院60例老年COPD合并缺血性腦卒中患者（A組），60例單純老年COPD患者（B組），60例缺血性腦卒中患者（C組）和60例健康志愿者（D組）。納入標準：（1）COPD急性和穩定期，缺血性腦卒中急性期；（2）年齡65～80歲；（3）入院治療前采集數據，完整可分析。排除標準：（1）合并肺部其他疾病，如肺癌、肺炎、哮喘、呼吸衰竭等，缺血性腦卒中穩定期，其他腦源性疾病，如出血性腦卒中、腦腫瘤、腦炎等；（2）合并其他基礎疾病，如心、肝、腎等臟器功能障礙，自身免疫性疾病，全身感染性疾病，傳染性疾病等。

該研究取得我院倫理委員會通過及患者、家屬的知情同意權，其中A組男性26例，女性24例；年齡66～78歲，平均（72.3±10.2）歲；COPD病程1～8年，平均（4.2±2.5）年；COPD急性期24例，穩定期 26例；缺血性腦卒中病程 0.5～3h，平均（1.3±0.6）h；合并高血壓12例，糖尿病6例，吸煙20例。B組男性25例，女性25例；年齡 68～79歲，平均（73.5±12.4）歲；COPD 病程 2～9年，平均（4.6±2.4）年；COPD急性期23例，穩定期27例；合并高血壓13例，糖尿病5例，吸煙22例。C組男性24例，女性26例；年齡68～80歲，平均（73.6±12.5）歲；缺血性腦卒中病程 1.0～3.5h，平均（1.6±0.8）h；合并高血壓14例，糖尿病8例，吸煙16例。D組男性26例，女性24例；年齡67～80歲，平均（73.8±11.8）歲；合并高血壓16例，糖尿病7例，吸煙19例。組間的基線資料具有可比性。

1.2 研究方法

采用實時定量PCR法檢測外周血miR-210的表達水平，采用日本HI-801型便攜式肺功能儀檢測病情穩定后的肺功能。

PCR 法主要儀器：9600 型 PCR 擴增儀（美國 ABI 公司），RTPCR 檢測儀（美國 Bio-Rad 公司），BCM-8 超凈工作臺（北京六一廠），微量移液器（德國 Eppendorf 公司）。

主要步驟：抽取外周肘靜脈血5mL，3000g離心20min后-20℃保存待檢。應用美國Invitrogen公司提供的AM1556試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計（美國 Bio-tek 公司）測定 RNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳測定 RNA 完整性。美國Media Cybernetics公司提供的TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 試劑盒合成cDNA，引物設計（美國應用生物系統公司）：miR-210（F）：5’- TGCGGCTGTGCGTGTGACAG-3’，(R)：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’; 應用小鼠 hsa-miR -16(5’-UA GCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’)作為內參基因。反應體系：1:20RT 產物 cDNA 5.0 μL+ 5 pmol/μL PCR 正負向引物各 0.5 μL+2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL 加水至 20 μL。反應條件：95 ℃預變性 5 min，95 ℃變性 15 s、65 ℃ 退火 15 s、72 ℃ 延伸32 s，共40個循環，融解曲線分析溫度 60 ℃-95 ℃。結果以目的基因與內參基因比值表示，采用2-⊿⊿Ct法。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法檢驗，計數資料以率表示，組間比較用χ2檢驗；miR-210診斷的敏感性和準確性采用受試者工作曲線（ROC）分析；P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組間miR-210水平的比較

A組的miR-210水平最低，其次為B組和C組，D組最高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

120例 COPD患者的肺功能結果顯示，FEV1/FVC＞0.7，FEV1≥ 0.8共 22例（肺 功 能 減 退 傾 向）；FEV1/FVC≤ 0.7，FEV1≥0.8共42例（輕度肺功能減退）;FEV1/FVC≤0.7，FEV1在0.5～0.8共 38例（中度肺功能減退）;FEV1/FVC≤0.7，FEV1在0.3～0.5共 12例（重度肺功能減退）;FEV1/FVC≤0.7，FEV1＜0.3共6例（特重度肺功能減退）。miR-210水平隨肺功能減退程度加重而降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 組間miR-210水平的比較注：A組，老年COPD合并缺血性腦卒中；B組，老年COPD;C組，缺血性腦卒中；D組，健康志愿者）

圖2 不同肺功能的miR-210水平比較（1為C組和D組，2為肺功能減退傾向，3為輕度肺功能減退，4為中度肺功能減退，5為重度肺功能減退，6為特重度肺功能減退）

2.2 ROC曲線分析

以COPD為診斷標準，采用ROC曲線分析得出：miR-210的診斷敏感性85.6%，特異性72.6%，準確性（曲線下面積）0.821,95%CI為0.632～0.924；以缺血性腦卒中為診斷標準，miR-210的診斷敏感性81.2%，特異性78.3%，準確性0.802，95% CI為0.635～0.945，見圖 3。

圖3 miR-210診斷COPD和缺血性腦卒中的ROC分析

3 討論

miRNAs可以與目標靶mRNA 3’ 端非翻譯區結合，使轉錄后的基因表達沉默，在發育、細胞分化、增殖和凋亡等生物學過程中發揮重要作用。COPD的發生與環境污染和吸煙密切相關，研究證實，miR-210在COPD患者中表達下調，增加PGE2的表達；在缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的誘導下，p53基因表達增強，miR-210表達降低，與HIF-1α呈正相關，調控AKT的失活[4]；p53基因可調控miR-210在DNA損傷反應中的表達，抑制DNA修復過程[5]。通過該研究得出：COPD合并缺血性腦卒中組的miR-210水平最低，其次為COPD組和缺血性腦卒中組，健康志愿者組最高，差異有統計學意義。進一步分析，miR-210水平隨肺功能減退程度加重而降低，差異有統計學意義。ROC分析得出：miR-210診斷COPD的敏感性85.6%，特異性72.6%，準確性0.821。證實，miR-210在COPD中表達下調，與病情嚴重程度相關，可作為疾病診斷的敏感性指標。

缺血性腦卒中的發生、發展和神經修復過程中，miR-210對細胞增殖和細胞周期的調控可通過下調細胞增殖蛋白表達，其中E2F3是直接靶點，在DNA復制的過程中E2F3調控細胞周期從G1過渡到S期，促進細胞增殖；此外，FGFRL1和HOXA1也是miR-210作用的蛋白質靶點，HOXA1的過度激活可活化P44/42MAP激酶，促進細胞增殖。miR-210可下調促凋亡半胱氨酸蛋白酶8（Caspase-8）的表達，提高間充質干細胞的存活[6]。miR-210誘導血管新生依賴于Dicer基因的表達，miR-210是血管內皮細胞存活、遷移的關鍵調節因素。正常的血管內皮細胞中miR-210呈過表達，通過下調靶基因ephrinA3的表達促進血管新生。研究證實，miR-210的表達水平與缺血性腦卒中的嚴重程度相關。miR-210促進神經再生的機制是通過抑制半胱天冬酶的活性來抑制神經元的凋亡，調控bcl-2和bax水平的平衡[7]。通過該研究得出：COPD合并缺血性腦卒中組的miR-210水平比單純COPD和缺血性腦卒中更低，提示miR-210與COPD和缺血性腦卒中的發病均相關。ROC分析得出， miR-210診斷缺血性腦卒中的敏感性81.2%，特異性78.3%，準確性0.802.提示，miR-210在缺血性腦卒中表達下調，可作為疾病診斷的敏感性指標。

綜上所述，miR-210在COPD和缺血性腦卒中表達下調，可作為診斷COPD和缺血性腦卒中的敏感性指標。