高通量基因測序技術檢測早期流產絨毛染色體異常及相關因素分析

許展，程東凱，于洪君，李寶山，劉雙

（沈陽東方菁華醫院有限公司，遼寧 沈陽）

0 引言

妊娠早期流產是通過輔助生殖治療(ART)懷孕最常見的并發癥，胚胎染色體異常約占這些損失的50%[1]。據報道，與自然受孕相比，ART所用的技術可能會增加懷孕產生染色體異常的風險，并導致早期妊娠損失[2]。G顯帶核型分析是染色體分析的傳統方法，對探討自然流產的原因具有重要意義。然而，G顯帶的核型分析受到染色體準備不良、培養失敗和母體細胞污染的等因素的限制。分子核型方法，如多重熒光原位雜交(mFISH)，多重連接依賴探針擴增(MLPA)，定量實時聚合酶鏈反應(qPCR)，克服了傳統細胞遺傳學技術固有的一些缺點[3,4]。然而，他們因其分辨率有限和/或整個基因組覆蓋范圍有限而受到質疑。在本研究中，我們應用高通量測序技術來檢測早期自發性流產的女性絨毛樣本，分析流產可能發生的原因，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 樣本收集和DNA提取

本研究經沈陽東方菁華醫院機構審查委員會批準。在知情同意的情況下，收集了2015年1月至2018年12月189例自發性流產婦女的絨毛樣本（ART共166例，自然妊娠組共23例）。每個樣品在生理鹽水中漂洗三次。然后用DNA提取試劑盒提取10mg組織以提取基因組DNA（天根生化科技（北京）有限公司）。

1.2 高通量測序技術進行染色體拷貝數分析和驗證

使用Ion torrent PGM試劑盒(ThermoFisher，美國)將絨毛樣本基因組DNA剪切至250-300 bp片段。使用Ion Plus片段庫工具包(ThermoFisher，美國)構建離子種子條形碼庫。使用IonPGM模板OT2 200試劑盒（美國ThermoFisher）用于模板擴增和靶序列富集。使用Ion OneTouch ES（ThermoFisher，美國）回收離子球顆粒（ISP）并富集模板陽性ISPs。使用Ion PGM Sequencing 200 Kit v2（ThermoFisher，USA）在'318'測序芯片上進行測序，共有500個核苷酸流，平均讀取長度為220-230 bp。10個DNA樣本匯集在一起，并在“318”芯片上標記不同的條形碼。全基因組序列平均深度為～0.02×，平均讀數為～500k。主要測序BAM數據提交到Celloud cloud服務器(http://www.celloud.org/)，該服務器由第三方公司(JBRH，中國)提供，用于分析染色體拷貝數變異(CNVs)。

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，數據統計采用χ2檢驗，當1≤理論頻數＜5，用校正χ2檢驗比較P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 異常核型情況

189例絨毛組織中染色體異常124例，正常65例，染色體異常率65.61%（124/189）。流產組織染色體非整倍性發生率為65.61%（124/189），其中三倍體占37.10%（46/124）。三倍體中發生頻次以16三體占比最高，可達23.91%（11/46）、其次是22三體占21.74%（10/46）以及Turner綜合征占8.70%（4/46）。見表1。

表1 異常核型情況

2.2 孕婦年齡與絨毛染色體異常發生率

孕婦年齡大于35歲組染色體異常發生率明顯高于年齡小于35歲組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 孕婦年齡與染色體異常發生率

2.3 初次自然流產和復發性流產絨毛染色體異常發生率比較

既往有2次及2次以上自然流產病史的孕婦染色體異常68%（17/25）雖高于首次發生自然流產患者65.24%（107/164），但差異無統計學意義，P＞0.05。見表3。

表3 自然流產次數與染色體異常發生率

2.4 自然妊娠和ART妊娠絨毛染色體異常發生率比較

ART組與NC（自然妊娠）染色體異常率分別為64.46%（107/166）、73.91%（17/23），差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 自然妊娠與ART妊娠絨毛染色體異常發生率

2.5 孕周與絨毛染色體異常發生率

孕周大于9周的患者染色體異常率73.24%（52/71）也略高于孕周小于9周的患者61.02（72/118），但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 5。

表5 孕周與染色體異常發生率

3 討論

輔助生殖技術已成為許多不孕不育夫婦的重要治療手段和基本技術。雖然多個不孕不育治療中心ART妊娠率穩定在40%左右，但帶回家的嬰兒率仍為20-30%，其中一個重要原因是早期自然流產率較高的[5]。妊娠早期流產在所有臨床診斷的妊娠中占10%-15%，其中胚胎染色體異常是自發性流產最常見的原因，約占60%。然而，ART術后患者的早期自然流產率在22%-63%之間。ART治療的失敗與許多因素有關，遺傳缺陷尤其是胚胎染色體異常是導致妊娠早期自發性流產的主要原因之一[6]。

妊娠產物的細胞遺傳學分析是探討自然流產原因的基礎。多重細胞遺傳學分析表明，在不同的人群中，妊娠早期流產的非整倍率在50%-80%之間[7]。細胞遺傳學的異常核型包括常染色體三體、性染色體單體、三倍體、雙三體、多倍體以及結構重排。其中常染色體三體是最常見的染色體異常。

常規g顯帶染色體分型是檢測染色體非整倍性和不平衡的金標準方法。但總體檢測失敗率約為20%，有時由于母體細胞相對于胎兒細胞過度生長而出現假陰性結果。最近，高通量測序技術被證實能夠可靠地檢測絨毛樣本中的CNVs[8]。Array CGH和NGS都是高通量的基因檢測平臺，對傳統的細胞遺傳學產生了革命性的影響[4,9]。本研究采用NGS方法檢測染色體拷貝數分析異常，對流產胚胎染色體異常檢出率65.24%。本研究分析了流產組織染色體非整倍性發生率，其中三倍體占37.10%，三倍體中發生頻次以16三體占比最高，可達23.91%。

母體高齡、核型改變、多種輔助生殖技術(ART)失敗、多次流產、Mesa-Tese獲得精子等不良因素導致胚胎染色體異常風險增加[10]。在ART中，孕婦年齡可能被認為是影響妊娠結局的最重要因素。對于不育夫婦，流產的風險和非整倍體率已知會隨著產婦年齡的增長而高度增加[11]。本研究結果指出孕婦年齡大于35歲組染色體異常發生率明顯高于年齡小于35歲組，差異有統計學意義。盡管尚未完全理解年齡效應的發病機理，但認為它是由卵母細胞中第一減數分裂產生的錯誤引起的[12]。隨著年齡的增長，女性的卵母細胞減數分裂錯誤的發生率增加，這是由于卵子在排卵前被阻滯在第一減數分裂中的時間延長。而減數分裂紡錘體形態也被發現隨著母體年齡的增加而發生有害地改變。

此外，本研究還發現流產次數對胚胎染色體異常無顯著影響，ART也并沒有增加胚胎染色體異常率。

綜上，染色體異常是胚胎早期停止發育流產的重要原因，其中孕婦高齡可能使胚胎染色體異常發生的幾率增高，高齡人群應更注重孕早期胎兒染色體檢查；與NC相比ART不會增加胚胎染色體異常的發生率。