硝苯地平緩釋片含量測(cè)定方法的改進(jìn)與研究

王濤，高園霞，王發(fā)，王嫦鶴

（1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安；2.西安力邦制藥有限公司，陜西 西安）

0 引言

硝苯地平緩釋片，英文名：Nifedipine Sustained release tablets，本品主要成分為硝苯地平，中文別名：利心平； 1，4-二氫-2，6-二甲基-4-（2-硝基苯基）-3，5-吡啶二羧酸二甲酯； 心痛定； 硝苯吡啶；英文名稱：Nifedipine。

相關(guān)文獻(xiàn)[1-4]表明，硝苯地平為第一代二氫吡啶類鈣拮抗劑，可選擇性抑制鈣離子進(jìn)入心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并抑制鈣離子從細(xì)胞內(nèi)庫(kù)釋放，而不改變血漿鈣離子濃度。用于預(yù)防和治療冠心病心絞痛，特別是變異型心絞痛和冠狀動(dòng)脈痙攣所致心絞痛。對(duì)呼吸功能沒有不良影響，故適用于患有呼吸道阻塞性疾病的心絞痛患者，其療效優(yōu)于β受體拮抗劑。還適用于各種類型的高血壓，對(duì)頑固性、重度高血壓也有較好療效。由于能降低后負(fù)荷，對(duì)頑固性充血性心力衰竭亦有良好療效，宜于長(zhǎng)期服用。增加硝苯地平劑量可使外周血管過(guò)度擴(kuò)張，導(dǎo)致或加重低血壓狀態(tài)。

因此，嚴(yán)格控制硝苯地平的含量顯得尤為重要，在2019年抽檢過(guò)程中，硝苯地平緩釋片以往的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第五十二冊(cè)》中含量測(cè)定方法為紫外-可見分光光度法，該方法專屬性不夠，雜質(zhì)以及輔料對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大，本文針對(duì)此類情況進(jìn)行了高效液相色譜法的方法學(xué)研究，根據(jù)中國(guó)藥典以及相關(guān)文獻(xiàn)[5-10]，建立了硝苯地平的簡(jiǎn)便快速、定量準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，用于對(duì)其含量進(jìn)行更精確的控制，為群眾安全用藥提供保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國(guó)Waters公司高效液相色譜儀（Alliance E2695色譜系統(tǒng)，2489紫外檢測(cè)器，Empower工作站），美國(guó)賽默飛Evolution 300型紫外-可見分光光度計(jì)，瑞士梅特勒公司ME204型、XPE105型全自動(dòng)電子分析天平，超聲波清洗器（KQ-500DE型，昆山超聲儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，默克公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為電阻率為18.3ΜΩ·CM的超純水；硝苯地平雜質(zhì)A對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，規(guī)格：30mg，含量：99.7%，批號(hào)：100340-201103）和硝苯地平雜質(zhì)B（中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，規(guī)格：30mg，含量：100%，批號(hào)： 100340-200602） ；硝苯地平對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，規(guī)格：100mg，含量：99.9%，批號(hào)：100338-201404）。

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品

硝苯地平緩釋片（I）（德州德藥制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：2101190317）；硝苯地平緩釋片（I）（亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：19040131）；硝苯地平緩釋片（I）（陜西省萬(wàn)壽制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：190504）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agela Technologies C18（150×4.6 mm，5μm），十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：水-甲醇（40：60）；柱溫：35℃；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm；進(jìn)樣體積：20μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制

避光操作。精密稱取硝苯地平對(duì)照品10.12mg，置50mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取5mL，置50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制

避光操作。取本品20片，除去包衣，精密稱定，精密稱取適量（約相當(dāng)于硝苯地平10mg），置50mL棕色容量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5mL，置50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)

避光操作。精密稱取硝苯地平雜質(zhì)A對(duì)照品10.06mg；硝苯地平雜質(zhì)B對(duì)照品10.18mg，硝苯地平對(duì)照品10.12mg，置于同一50mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照溶液；取空白溶液、硝苯地平對(duì)照品溶液、混合對(duì)照溶液、樣品溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖。在此色譜條件下，硝苯地平樣品溶液主峰與對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致，混合對(duì)照溶液中硝苯地平峰能與其他色譜峰分離度均大于1.5。理論板數(shù)按硝苯地平峰計(jì)算不低于3000。

2.4 檢測(cè)限和定量限

取上述2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液用甲醇逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣，按10倍信噪比計(jì)算，得出上述色譜條件下的硝苯地平的定量限為0.506ng。

圖1 HPLC色譜圖A.空白溶液(Blank solution)；B.對(duì)照品溶液（Control solution）；C.混合對(duì)照溶液（Mixed control solution）；D.樣品溶液（Sample solution）1.硝苯地平雜質(zhì)A（Nifedipine impurity A）；2.硝苯地平雜質(zhì)B（Nifedipine impurity B）；3.硝苯地平（Nifedipine）

取上述2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液用甲醇逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣，按3倍信噪比計(jì)算，得出上述色譜條件下的硝苯地平的檢測(cè)限為0.2024ng。

2.5 線性關(guān)系考察試驗(yàn)

避光操作。精密吸取對(duì)照品貯備液1mL、2mL、3mL、5mL、10mL各置50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得一系列濃度的線性關(guān)系對(duì)照品溶液，量取上述5個(gè)溶液各精密量取20μL，分別注入液相色譜儀中，以濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程：Y=72454+6260，回歸系數(shù)：r=1.0000；結(jié)果表明硝苯地平在4.0～40.0μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

避光操作。取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，取上述對(duì)照溶液20μL注入高效液相色譜儀，在上述的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行分析測(cè)定，記錄硝苯地平峰面積，對(duì)照品溶液硝苯地平的峰面積RSD值為0.7%，說(shuō)明該方法的精密度良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

避光操作。精密稱取硝苯地平對(duì)照品12mg，10mg，8mg，各三份，置9個(gè)50mL棕色容量瓶中，取硝苯地平緩釋片（I）（陜西省萬(wàn)壽制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：190504）20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取9份（每份約相當(dāng)于硝苯地平10mg），置上述9個(gè)50mL棕色容量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5mL，置100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為回收率溶液。取上述回收率溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖。計(jì)算回收率，結(jié)果硝苯地平的平均回收率為99.42%， RSD為0.23%。結(jié)果見表1。

表1 硝苯地平回收率測(cè)定結(jié)果

2.8 重復(fù)性

避光操作。取2.7項(xiàng)下樣品細(xì)粉，精密稱取6份（每份約相當(dāng)于硝苯地平10mg），置上述6個(gè)50mL棕色容量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5mL，置50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為重復(fù)性實(shí)驗(yàn)溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖。6份樣品含量測(cè)定結(jié)果見表2，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好，硝苯地平含量均值為99.95%， RSD為0.51%。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

避光操作。取2.8項(xiàng)下供試品溶液1，分別在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)各取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，溶液在24小時(shí)室溫放置，樣品峰面積基本不變，各圖譜中硝苯地平峰面積RSD為0.16%。結(jié)果表明，本法測(cè)定硝苯地平供試品溶液在避光條件下在24小時(shí)內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.10 耐用性

避光操作。取2.3項(xiàng)下對(duì)照品溶液、混合對(duì)照溶液、樣品溶液，各量取 20μL，分別在 20、25、30、35、40℃柱溫條件下注入色譜儀，記錄色譜圖，比較各組分在不同柱溫下的分離情況。由結(jié)果可看出柱溫的變化對(duì)各組分分離情況無(wú)影響，該方法對(duì)溫度耐用性良好。

2.11 含量測(cè)定

避光操作。取硝苯地平對(duì)照品以及1.3項(xiàng)下三批樣品，按照2.2項(xiàng)下方法制成對(duì)照溶液與供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析；同時(shí)按《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第五十二冊(cè)》中含量測(cè)定方法測(cè)定該三批樣品含量，結(jié)果見表3。

3 小結(jié)與討論

3.1 溶劑的選擇

硝苯地平在丙酮和三氯甲烷中易溶，在甲醇中可溶，水中幾乎不溶，出于對(duì)安全性和溶解性的考慮，選擇甲醇作為其溶劑。

表3 含量測(cè)定結(jié)果表

3.2 色譜柱的選擇

選定C18柱為分析柱后，比較了Agela Technologies C18（150×4.6 mm，5μm），Capcell PAK C18 （150×4.6 mm，5μm），結(jié)果表明 Agela Technologies C18（150×4.6 mm，5μm）柱的分離效果和耐用性更好。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

硝苯地平在320～355nm波長(zhǎng)范圍呈較大的寬幅吸收，在235nm波長(zhǎng)處有較大的吸收，其吸光值為333nm波長(zhǎng)處的4.4倍；另外由于硝苯地平的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，見光可發(fā)生降解，且降解產(chǎn)物在333nm波長(zhǎng)處均有吸收，故選擇波長(zhǎng)為235nm為其檢測(cè)波長(zhǎng)。