鴉膽子油乳灌腸抗潰瘍性結腸炎大鼠結腸粘膜損傷的作用及機理研究

王建波，路士華，王偉，王偉明

（山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250011）

0 引言

潰瘍性結腸炎（UC）是全球性疾病，由于其發病原因及機制尚不完全清楚，臨床尚缺乏令人滿意的治療手段，該病纏綿難愈，易復發，且有癌變傾向，已被WHO 列為現代難治病之一[1-3]。大量文獻資料及臨床實踐證實中醫藥治療本病具有獨特的優勢[3-5]，所以深入探索中醫有效方藥，具有十分重要的理論及實踐價值。課題組通過前期大量的臨床觀察，發現潰瘍性結腸炎患者，特別是處于活動期的患者，多表現為熱毒內盛的證候，基于此種臨床現象，我們應用鴉膽子油乳保留灌腸治療，在臨床應用中取得了顯著的效果。本研究旨在前期臨床工作的基礎上，進一步通過實驗研究，觀察鴉膽子油乳對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織損傷的修復，以及對結腸組織中IL-6、IL-10 及對TNF-α 含量的影響，以探討鴉膽子油乳治療潰瘍性結腸炎的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料。清潔級Wistar 雄性大鼠60 只，鼠齡12 周，體重（280±25）g。購自山東大學醫學院動物實驗中心，實驗動物合格證 SCXK（魯）2016-0001。

1.2 受試藥物。鴉膽子油乳注射液，生產企業：廣州白云山明興制藥有限公司，批準文號：國藥準字12054324Z，規格10 mL/支。美沙拉嗪腸溶片，生產企業：由佳木斯鹿靈制藥有限責任公司生產，國藥準字H19980148，規格0.25 g/粒。

1.3 試劑與儀器。2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS） 溶液（美國Sigma 公司），購于上海易佰聚經貿有限公司；大鼠TNF-α、IL-6、IL-10 檢測試劑盒，均購自濟南森艾狄生物科技有限公司；Allegra X-15R 離心機（美國Beckman Coulter Inc.）；DY89-II 電動玻璃勻漿機，（寧波新芝生物科技股份有限公司）；UV1902PC 紫外可見分光光度計：（上海奧析科學儀器有限公司）；ELx808 吸收光酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與造模：適應性飼養大鼠1 周后隨機分為6 組：正常對照組，UC 模型對照組，鴉膽子油乳低、中、高劑量組和西藥對照美沙拉嗪組（以下簡稱正常組、模型組、鴉膽子油乳低劑量組、鴉膽子油乳中劑量組、鴉膽子油乳高劑量組、西藥組）），每組10 只。造模前禁食24 h，留取10 只作為正常組，其余大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，用雙豬尾管從肛門插入，深度為8 cm，推入TNBS 溶液（含2.5% TNBS、50%乙醇）4 mL/kg 體重，捏緊肛門平放5 min 即可[6]。

1.4.2 給藥方法：鴉膽子油乳注射液給藥量：大鼠低、中、高劑量分別按成人用量的5 倍、10 倍、20 倍計算，即2.5 mL/kg，5 mL/kg，10 mL/kg 藥物，用生理鹽水配成250 mL/L，500 mL/L，1000 mL/L。西藥組：大鼠劑量按成人10倍用藥劑量，即0.5 g/kg，美沙拉嗪用生理鹽水配成50g/L。造模成功后第3 天，將UC 模型動物分為模型組、鴉膽子油乳低劑量組、鴉膽子油乳中劑量組、鴉膽子油乳高劑量組、西藥組，開始灌腸給藥，給藥量為l0 mL/kg 體重。正常組，模型組給等體積生理鹽水，每天1 次，連續干預18 天。

1.4.3 標本采集：實驗結束后各組小鼠禁食不禁水24 小時稱體重后，均以頸椎脫臼法處死，取出肛門至盲腸末端的整個結腸和直腸段，剖開腸管，用冷生理鹽水將結腸沖洗干凈，用濾紙吸干后，觀察各組大鼠結腸的大體改變；在病變最明顯處取3 段長約1 cm 的小鼠結腸組織，福爾馬林浸泡固定，以備制作病理切片；其余結腸剪短后置于1.5 mL 離心管中，-80℃冰箱中保存備用。

1.4.4 病理切片制作及組織學評分：結腸組織標本用10%福爾馬林溶液浸泡固定，常規石蠟包埋、切片，HE 染色，中性樹脂膠封片，光鏡下觀察病理改變并進行組織學評分。組織學評分標準[7]：無損傷為0 分；腸壁粘膜少量炎細胞浸潤，黏膜下充血或出血；為1 分；上皮覆蓋不全或不成熟，黏膜層及黏膜下層大量慢性炎性細胞浸潤為2 分；明顯充血水腫，黏膜層及黏膜下層大量中性粒細胞浸潤，隱窩腫壞死及潰瘍形成為3 分。

1.4.5 檢測指標：采用ELISA 法檢測結腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α 含量。

1.5 統計學分析。實驗數據結果采用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，差異比較用均值±標準差表示，組間比較采用t 檢驗法，P＜0.05 提示差異有統計學意義，P＜0.01 提示差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 結腸粘膜損傷情況。結果顯示，模型組評分明顯高于空白組，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），說明造模成功。鴉膽子油乳中、高劑量組及西藥組評分均不同程度降低（P＜0.01 或P＜0.05），其中，高劑量組明顯優于中劑量組及西藥組，但與西藥組之間比較無統計學意義（P＞0.05）。結果說明，各組均可減輕粘膜組織損傷，作用效果依次為高劑量組、中劑量組、西藥組、低劑量組，結果見表1。

表1 各組組織評分比較

表1 各組組織評分比較

注：與正常組比較：●P＜0.01。與模型組比較：△P＜0.05，▲P＜0.01，＃P＞0.05。與美沙拉嗪組比較：￡P＜0.05，■P＜0.01，※P＞0.05。

組別 組織評分正常組 0.20±0.42模型組 2.90±0.57●鴉膽子油乳低劑量組 2.50±0.71●＃￡鴉膽子油乳中劑量組 2.20±0.79●△※鴉膽子油乳高劑量組 1.80±0.63●▲※西藥組 2.00±0.67●△

2.2 結腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α 含量測定結果。IL-6比較：與模型組比較，鴉膽子油乳中劑量組、鴉膽子油乳高劑量組、西藥組差異特別顯著（P＜0.01）。但與西藥組比較，鴉膽子油乳中劑量組、高劑量組無顯著差異（P＞0.05）。結果說明，各組均能有效降低IL-6 的表達，其中鴉膽子油乳低、中、高劑量組均能降低IL-6 的表達，且呈現一定的量效關系，高劑量組作用最為顯著，優于西藥對照組，但與西藥組比較無統計學意義（P＞0.05）。IL-8 比較：與模型組比較，鴉膽子油乳低劑量組差異顯著（P＜0.05），鴉膽子油乳中劑量組、鴉膽子油乳高劑量組、西藥組差異特別顯著（P＜0.01）。與西藥組比較，低劑量組、中劑量組差異顯著（P＜0.05），而高劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）。結果說明，各組均能有效增加IL-8 的表達，尤以中劑量組、高劑量組作用顯著，其中高劑量組與西藥組作用相當。TNF-α 比較：與模型組比較，鴉膽子油乳中劑量組、鴉膽子油乳高劑量組、西藥組差異特別顯著（P＜0.01）。與西藥組比較，低劑量組、中劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），而高劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）。結果說明，各組均能有效降低TNF-α 的表達，以中劑量組、高劑量組、西藥組尤為顯著，高劑量組與西藥組作用相當，結果見表2。

表2 各組炎性指標比較，pg/mL）

表2 各組炎性指標比較，pg/mL）

注：與正常組比較：◎P＜0.05，●P＜0.01，＆P＞0.05。與模型組比較：△P＜0.05，▲P＜0.01。與西藥組比較：￡P＜0.05， ■P＜0.01，※P＞0.05。

組別/指標 IL-6 IL-8 TNF-α正常組 117.61±1.49 296.25±28.24 36.27±2.72模型組 200.95±4.18● 91.25±12.66● 80.22±4.31●低劑量組 178.71±1.84●△□ 126.25±14.92●△￡ 62.38±3.95●△￡中劑量組 147.71±3.02◎▲※ 206.25±11.45◎▲￡ 42.61±5.01◎▲￡高劑量組 131.98±2.16◎▲※ 257.50±18.52＆▲※ 49.11±4.44◎▲※西藥組 141.28±3.91◎▲ 260.25±17.56＆▲ 52.38±3.13◎▲

3 討論

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）為炎癥性腸病，目前對本病的發病原因及機制尚不明確，多認為主要涉及免疫、感染、遺傳等因素有關。中醫學中并無潰瘍性結腸炎此病名，從其臨床表現特征來看，應歸屬中醫學“休息痢”、“腸風”、“臟毒”等范疇，而其病因多與稟賦不足、飲食失節與情志內傷等有關[8]。其病機課題組從多年臨床實踐觀察中總結認為，脾氣虧虛為其始動因素，而濕、熱、瘀、毒既是病理產物，又是本病反復發作，纏綿不愈的重要致病因素。依據此理論，我們針對潰瘍性結腸炎活動期以熱、毒等標實為突出矛盾的臨床特點，我們采用鴉膽子油乳灌腸治療取得了良好的臨床效果。鴉膽子味苦、性寒涼，鴉膽子具有清熱解毒、止痢的功效，切合病機，由于其具有腐蝕贅疣的作用，尤其適用于伴有炎性息肉的UC 患者。

中藥鴉膽子為苦木科鴉膽子屬植物鴉膽子（Brucea j avanica L.Merr.）的干燥成熟果實，該藥材原植物主產于我國南方沿海熱帶和亞熱帶地區[9]。鴉膽子始載于清代趙學敏的《本草綱目拾遺》，具有清熱解毒、截瘧止痢、腐蝕贅疣的功效[10]。歷史上我國民間廣泛應用鴉膽子治療痢疾等疾病，如張錫純提倡用鴉膽子治療痢疾，其在《醫學衷中參西錄》謂其“味極苦，性涼，為涼血解毒之要藥，善治熱性赤痢……最能清血分之熱及腸中之熱，防腐生肌，誠有奇效”[11]。鴉膽子油乳為鴉膽子果實中提取得到的脂肪油乳化制成，主要有效成分為油酸和亞油酸[10]，有研究表明具有抗腫瘤、提高機體免疫功能、抑菌、抗炎等多方面的生物活性，其油乳劑優點在于可以提高藥物對皮膚 以及黏膜的穿透性并減輕藥物對生理組織的刺激性[12-14]。

免疫機制在潰瘍性結腸炎發病中的作用己得到醫學界公認，其中細胞因子在腸道免疫反應中發揮著關鍵性的作用，腫瘤壞死因子、IL-6 和IL-8 等促炎癥細胞因子被認為是的能介導潰瘍性結腸炎發病的細胞因子，而一些細胞因子IL-4、IL-10 等則具有抗炎作用[15]。促炎與抗炎因子的平衡狀態在潰瘍性結腸炎的發病及發展過程中起到了非常重要的作用，并且與病情嚴重程度有關。檢測TNF-a 的水平對UC 的診斷、活動情況及預后判定均具有重要意義，并可通過減少TNF-a、IL-6、IL-10 的表達或抑制生物學功能來治療潰瘍性結腸炎。

本項研究發現，鴉膽子油乳注射液具有明確治療潰瘍性結腸炎的作用，不僅可使潰瘍性結腸炎模型大鼠的結腸黏膜得到明顯修復與改善，并可升高結腸組織中細胞因子IL-10的含量，降低結腸組織中細胞因子IL-6 的含量，同時還能明顯降低結腸組織中 TNF-a 的表達。由此推測，鴉膽子油乳注射液可能是通過抑制TNF-a 的表達，減弱了其作為啟動因子的級聯炎性反應鏈的擴大，減少促炎癥介質的釋放，增加保護因子的釋放，發揮抗炎作用，從而發揮其治療潰瘍性結腸炎的作用。