白藜蘆醇通過靶向SIRT1激活Keap1-Nrf2-HO-1途徑發揮對草酸鈣腎結石形成的調控作用

田 河，王志龍，張智慧，宋 靜，高 強，吳 影，南錫浩，郭振海，邸彥橙

(牡丹江醫學院附屬紅旗醫院，牡丹江 157011)

腎結石是泌尿外科常見疾病之一，而草酸鈣結石是最為常見的結石類型[1]。故通過研究草酸鈣腎結石的發病機制具有廣泛概括意義。一些研究證實，腎小管上皮細胞在高濃度的草酸和尿鈣通過脂質過氧化的情況下嚴重受損。腎結石的形成是一個復雜的過程，其形成與腎上皮細胞損傷相關，高草酸會損傷腎上皮細胞和細胞膜，然而晶體粘附是腎結石形成的重要環節，粘附的前提一般存在腎上皮細胞的損傷，這可能與損傷的腎上皮細胞為晶體提供粘附位點有關[2]。晶體粘附后進一步誘導ROS的產生，進一步損傷腎上皮細胞。因此腎小管細胞損傷被認為是腎晶體形成的主要危險因素。減輕高草酸引起的腎上皮細胞的損傷可能對于研究腎結石的形成具有重要的意義，對于腎結石預防尤為重要[3]。

白藜蘆醇化學名為芪三酚(3,5,4-trihydroxystilbene)，是葡萄屬植物產生的一種多酚類植物抗毒素，主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中，是天然的抗氧化劑和自由基清除劑[4]。且RSV是SIRT1的特異性激動劑，而近年來研究表明白藜蘆醇作為一種具有多種生物學功能化合物，具有降血脂、抗氧化損傷、抗腫瘤、保護心腦血管、抗衰老、保肝、免疫調節及雌激素樣作用。白藜蘆醇可通過激活SIRT1而減少氧化應激對草酸誘導的細胞發揮保護作用。EX527是一種有效的、選擇性sirt1抑制劑，EX527有效抑制SIRT1去乙酰化酶活性。對于研究白藜蘆醇對于HK-2的防護性機制具有重要作用。白藜蘆醇在草酸鈣結石中的抗氧化應激機制及其對Nrf2-ARE途徑的作用，目前國內外研究還較少。因此，研究SIRT1激動劑白藜蘆醇等能否通過信號通路維持氧自由基穩定、抵抗草酸引起的氧化應激損傷為白藜蘆醇等中成藥在腎結石疾病的防治應用中提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人腎上皮細胞(HK-2)購自于ATCC。HK-2屬于貼壁細胞，細胞使用RPMI1640培養基+1%三抗+10%FBS，細胞于37℃、5% CO2培養箱中培養，24 h換液。

1.2 主要試劑

白藜蘆醇、EX527、活性氧檢測試劑盒、相關ELISA試劑盒購自于碧云天生物科技有限公司；Sirt1、Keap1、Nrf2、HO-1抗體購自于CST；SiRNA-Sirt1購自于Sangon Biotech；RPMI1640培養基與FBS購自于Gibco。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

細胞實驗：將HK-2細胞分為對照組、草酸組、草酸+RSV、草酸+RSV+EX527組。

1.3.2 白藜蘆醇藥物毒性的篩選

(1)細胞鋪板：96孔板，每孔鋪8000個HK-2細胞。(2)鋪板10 h后進行藥物干預，藥物濃度分別為0 nM(con)、100 nM、500 nM、1 μM、5 μM。藥物干預24 h后進行CCK8實驗。(3)棄除上清，每孔按CCK8試劑/培養基10∶100的比例加入混合液。(4)2 h后于酶標儀進行檢測。

1.3.3 RSV對于HK-2細胞增殖的作用

將HK-2細胞分為對照組、草酸組、草酸+RSV、草酸+RSV+EX527組。各組進行24 h干預后進行CCK8實驗檢測HK-2增殖活性，CCK8方法同前。

1.3.4 Western blot法檢測RSV激動sirt1后各蛋白表達

(1)實驗分組：將HK-2細胞分為對照組、草酸組、草酸+RSV、草酸+RSV+EX527組。(2)細胞鋪板：每中皿鋪8×105個細胞。待細胞貼壁后進行干預。(3)蛋白提取，干預處理24 h后，裂解液裂解，隨后4℃，14 000 r/min 離心10 min，隨后取上清按5×比例加入上樣緩沖液，隨后100℃水浴10 min。隨后進行蛋白凝膠電泳及顯像分析。

1.3.5 qPCR法檢測各組HK-2中基因表達情況

運用TRIzol法提取HK-2細胞中的總RNA，隨后進行逆轉錄。逆轉錄體系為20 μL∶1 μL總RNA，4 μL 5×Reaction Mix，2 μL 10×Super Script Enzyme Mix，加入ddH2O將體系補足至20 μL，混勻后離心。反應條件為：37℃ 60 min，95℃ 5 min，置于4℃保存備用。按照qPCR試劑盒說明書進行轉錄擴增，反應體系為20 μL。使用SYBR Green染料法進行測定，每個樣本設置4個復孔。按照試劑盒說明書的反應條件進行擴增。基因的相對表達量用2-△△CT法進行計算。引物序列如下：

β-actin 正向序列：5’-CATTGCTGACAGGATG CAGAAGG-3’；反向序列：5’-TGCTGGAAGGTGG ACAGTGAGG-3’；

sirt1正向序列：5’-TAGACACGCTGGAACA GGTTGC-3’，反向序列5’-CTCCTCGTACAGCTT CACAGTC-3’；

TGF-β1正向序列：5’-TACCTGAACCCGTGTT GCTCTC-3’，反向序列：5’-GTTGCTGAGGTAT CGCCAGGAA-3’；

SMAD2正向序列：5’-GGGTTTTGAAGCCGTC TATCAGC-3’，反向序列：5’-CCAACCACTGTAGA GGTCCATTC-3’；

Nrf2正向序列：5’-CACATCCAGTCAGAAACC AGTGG-3’，反向序列：5’-GGAATGTCTGCGCCAA AAGCTG-3’。

1.3.6 流式細胞儀測定HK-2干預后活性氧水平

實驗分組同前。(1)細胞鋪板，6孔板每孔鋪4×105個細胞。貼壁后進行干預處理。(2)24 h后進行活性氧檢測，去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。37℃細胞培養箱內孵育20 min。用無血清細胞培養液洗滌細胞三次。(3)流式細胞儀檢測。

1.3.7 ELISA法測各組中TGF-β1、Smad2、sirt1和Nrf2含量

細胞上清樣品離心取上清(500 r/min，5 min)，隨后-80℃樣品保存。采用ELISA法測量各組HK-2細胞中TGF-β1、Smad2、sirt1和Nrf2含量。

1.3.8 siRNA干擾各組sirt1表達后，Western blot法檢測相關蛋白的表達

(1)胞鋪板：24孔板接種5萬個細胞每孔，每孔中加入約500 μL含血清的完全培養基，使轉染時的細胞密度能夠達到70%。(2)采取稀釋后的lipo2000與稀釋后的siRNA混勻孵育后感染細胞。(3)24 h后觀察熒光。Western blot實驗方法同前。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 白藜蘆醇藥物毒性的篩選

如圖1所示，白藜蘆醇藥物毒性實驗表明，與對照組相比，白藜蘆醇對于HK-2無毒性，統計學無明顯差異(P>0.05)。而其他濃度的白藜蘆醇均對HK-2有著不同程度的抑制作用，而且這種抑制作用與RSV的濃度梯度相關，表明RSV大于500 nM后，對于HK-2細胞存在明顯的藥物毒性作用。

2.2 白藜蘆醇對于HK-2細胞增殖的作用

如圖2所示，CCK8實驗表明，與對照組相比，草酸鈉抑制了HK-2的增殖(P<0.01)。與草酸鈉組相比，RSV緩解了草酸鈉對于HK-2的損傷(P<0.01)，但EX527解除了RSV對HK-2細胞的增殖作用(P<0.01)。

2.3 流式細胞儀測定HK-2干預后活性氧水平

如圖3所示流式細胞儀檢測各組活性氧水平結果表明，草酸鈉刺激HK-2活性氧的產生，然而RSV干預后的HK-2,草酸鈉刺激其產生活性氧的水平下降，應用sirt1抑制劑的EX527后，活性氧的產生水平恢復到原先水平。

2.4 Western blot法檢測 RSV激動sirt1后各蛋白表達

如圖4所示，與對照組相比，草酸鈉組HK-2細胞中sirt1表達下降，Keap1、Nrf2、HO-1表達降低,Smad2表達上調。與草酸鈉組相比，RSV應用后，sirt1表達上調，Keap1、Nrf2、HO-1表達上調(P<0.01)，Smad2/3表達下調(P<0.01)。然而應用EX527后，sirt1上調的相關蛋白表達下降。

注：NS：無統計學意義。圖1 白藜蘆醇藥物毒性的篩選Note. NS, not statistically significantFigure 1 Selecting of drug toxicity of resveratrol

2.5 qPCR法檢測各組HK-2中基因表達情況

如圖5所示，與對照組相比，草酸鈉組TGF-β1、Smad2/3/4mRNA表達上調，而sirt1 mRNA表達下調(P<0.01)。與草酸鈉組相比，應用RSV后TGF-β1(P<0.01)，Smad2(P<0.05)、Smad3(P<0.05)、Smad4(P<0.01)mRNA表達下調(P<0.01)，而sirt1 mRNA表達上調(P<0.01)。應用sirt1抑制劑后,與RSV組相比，TGF-β1(P<0.01)、Smad2/3/4(P<0.05)表達上調，sirt1 mRNA表達下調(P<0.05)。

2.6 siRNA干擾各組sirt1表達后，Western blot法檢測相關蛋白的表達

如圖6所示，應用siRNA-sirt1感染HK-2細胞后，Western blot 檢測sirt1的表達，與NC組相比，siRNA組sirt1表達明顯下調。如圖7所示，與草酸鈉組相比，siRNA干擾后，sirt1表達下調，Keap1、Nrf2、HO-1表達下調。沉默sirt1表達后，隨后應用RSV，發現RSV并不能抑制Smad2/3的激活。這與EX527作用相同。

圖2 白藜蘆醇對于HK-2細胞增殖的作用Figure 2 Effect of resveratrol on proliferation of HK-2 cells

圖3 流式細胞儀測定HK-2干預后活性氧水平Figure 3 Flow cytometry was used to determine the level of reactive oxygen species after HK-2 intervention

圖4 Western blot法檢測 RSV激動sirt1后各相關蛋白表達Figure 4 Western blot analysis of expression of related proteins after RSV activation of sirt1

圖5 qPCR法檢測各組HK-2中基因表達情況Figure 5 qPCR analysis of gene expression in each group of HK-2

圖6 siRNA干擾HK-2細胞sirt1表達Figure 6 siRNA interferes with sirt1 expression in HK-2 cells

圖7 siRNA干擾sirt1表達后，Western blot法檢測各實驗組相關蛋白的表達Figure 7 After siRNA interfered with the expression of siut1, Westem blot assay was used to detect the expression of related proteins in each experimental group

3 討論

氧化應激是由于活性氧(ROS)產生超過機體抗氧化能力而產生的。超過90%的ROS產生于呼吸鏈的線粒體中[4]。此外NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶、脂肪氧合酶也會增加細胞質內ROS的產生。在氧化應激存在時，機體的抗氧化能力減弱，能清除ROS的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及過氧化氫酶(CAT)等的含量降低，導致ROS的過度積聚[5]。而NADPH氧化酶中的核心部分p22phox會促使ROS的產生[6]。草酸作用細胞后會引起細胞產生大量的活性氧,進而對細胞造成氧化應激損傷。而體外實驗中加入活性氧清除劑N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)可減弱草酸對細胞的損傷。

機體在應對 ROS 損害時形成一套復雜的氧化應激應答系統，自身會誘導出一系列保護性蛋白，以減輕細胞發生的氧化應激損傷[7]。近年來，有研究發現核轉錄因子 NF-E2 相關因子 2 (Nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)和它的胞質接頭蛋白(Kelch like ECH associated protein 1, Keap1)是細胞抗氧化應激的中樞調節者[8]。正常情況下，Nrf2 和細胞骨架相關蛋白 Keap1 結合成二聚體的形式存在于細胞漿中，當受到外界氧化應激因子刺激后，Nrf2與 Keap1 解離并轉位進入細胞核，然后通過與抗氧化應激反應元件 ARE相互作用，誘導編碼抗氧化蛋白和 II 相解毒酶的表達，如γ谷氨酸合成酶(γ-GCS)血紅素氧合酶 1(HO-1)等[9]。故當受到氧化應激損傷時，機體會產生相應的自身防御反應，Keap1-Nrf2/ARE 通路是近年新發現的機體抵抗外界氧化和化學等刺激的防御性轉導通路[6]。Keap1-Nrf2/ARE通路下游的抗氧化酶HO-1是血紅素降解過程中的限速酶，研究證明，多種生長因子、氧化刺激因素、抗氧化藥物等能上調其表達[2]。而HO-1催化血紅素降解的三個產物: CO、膽紅素和鐵蛋白, 是發揮細胞保護作用的關鍵分子[10]。有學者發現HO-1對細胞和組氧化損傷起著重要的保護作用。故HO-1被認為是細胞氧化應激過程中一個非常敏感的指標[11]。

SIRT1 (沉默信息調節因子1)是NAD+ 依賴性蛋白脫乙酰酶，在細胞分化、衰老、凋亡、代謝調控、轉錄調節、信號轉到、氧化應激等多種重要的生物學過程中發揮重要作用[12]。而這種作用主要是通過去乙酰化激活NF-KB、叉頭蛋白轉錄因子家族(FOXOs)、過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)及其輔激活因子PGC1等[13]。既往研究已經證實SIRT1可通過抗炎、抗氧化、減少凋亡等機制發揮細胞保護作用[2]。

本實驗篩選了白藜蘆醇的最佳藥物劑量，同時發現不同濃度的白藜蘆醇存在不同程度放入藥物抑制作用。高草酸的環境對于人腎上皮細胞(HK-2)具有損傷作用，損傷可能通過抑制sirt1表達來實現的，因此應用sirt1的激動劑具有較好的防護性作用。RSV可以在適當藥物濃度下明顯抑制草酸鈉誘導的ROS的產生水平。這可能與sirt1被激活后，通過平衡Keap1/Nrf2/HO-1與TGF-β1發揮抗氧化，抗草酸鈣晶體粘附的作用有關。據研究表明心肌細胞Nrf2可以抑制TGF-β1/Smad2/3/4信號通路。因此，白藜蘆醇激動sirt1后，上調了Keap1/Nrf2/HO-1蛋白的表達，然而Nrf2表達上調后進一步抑制了TGF-β1的產生水平，從而發揮抗氧化作用，進而緩解了草酸鈉對于HK-2細胞的損傷作用。本實驗隨后又運用sirt1及抑制劑對于白藜蘆醇的作用及機制進行反向驗證，研究進一步表明白藜蘆醇激動sirt1后具有良好的防護性效應。

綜上所述，本研究表明白藜蘆醇對于HK-2細胞抗氧化作用，其機制可能是sirt1激活后，促進了Keap1、Nrf2、HO-1的表達，并進一步抑制了TGF-β1產生水平，從而抑制了ROS的產生。