莪術(shù)二酮對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠認(rèn)知功能及神經(jīng)功能的保護(hù)作用研究

李佳娜，郭蘇蘭，肖水秀

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518110)

缺血性腦病是由于腦局部供血不足或中斷而引起的腦組織局灶性損傷。缺血性腦病具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害著人們的健康[1-2]。臨床上治療時(shí)，往往通過(guò)藥物溶栓或其它手術(shù)方法實(shí)現(xiàn)血管再通，然而會(huì)進(jìn)一步引發(fā)腦缺血再灌注損傷[3]。目前，腦缺血再灌注損傷機(jī)制尚不明確，但有研究表明腦缺血再灌注損傷期間，血液系統(tǒng)有促凝傾向[4]，有研究發(fā)現(xiàn)抗凝藥物對(duì)腦缺血再灌注損傷有較好的保護(hù)作用，但由于有嚴(yán)重的出血副作用，限制了臨床應(yīng)用[5-6]。因此，尋找有抗凝作用和出血副作用小的抗腦缺血再灌注損傷新藥具有重要意義。

廣西莪術(shù)(Curcuma kwangsiensis S. G. Lee etC. F. Liang)為姜科姜黃屬植物廣西莪術(shù)的干燥根莖，是廣西的道地藥材[7]。莪術(shù)二酮是廣西莪術(shù)的主要有效成分之一，具有明顯抗血小板、抗炎和抗腫瘤作用等藥理作用[8-9]。關(guān)于莪術(shù)二酮對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠認(rèn)知功能及神經(jīng)功能的作用未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究旨在探討莪術(shù)二酮對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠認(rèn)知功能及神經(jīng)功能的保護(hù)作用，為莪術(shù)二酮的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)2月齡C57BL/c小鼠100只，雌雄各半，體重為18～22 g，購(gòu)買于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2016-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所SPF級(jí)屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(粵)2016-0122]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用過(guò)程中嚴(yán)格遵守3R原則，并得到了廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：2016005)。

1.2 主要試劑與儀器

莪術(shù)二酮(純度≥98%，批號(hào)：13657-68-6)購(gòu)于成都格利普生物科技有限公司；依諾肝素鈉注射液(批號(hào)：20170321)購(gòu)于法國(guó)Sanofi公司；血栓素B2(TXB2) ELISA試劑盒(批號(hào)：20170214)購(gòu)于南京建成生物工程研究所；6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α) ELISA試劑盒(批號(hào)：20170313)購(gòu)于南京建成生物工程研究所；一抗cAMP(貨號(hào)AB：26657，批號(hào)：20161204)和一抗p-CREB(貨號(hào)AB：26321，批號(hào)：20170121)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

BW-MWM101morris水迷宮：上海軟隆科技發(fā)展有限公司；550酶標(biāo)測(cè)定儀：日本Bio-red 公司；LG10-2.4 A型超速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；DGG-9070B電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；體式顯微鏡：深圳市西派克光學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠腦缺血再灌注損傷模型

小鼠按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組(20)、模型組(20)、低分子肝素鈉組(HS組，20)、莪術(shù)二酮低劑量組(CD-L組，20)和莪術(shù)二酮高劑量組(CD-H組，20)。各組小鼠于造模當(dāng)天連續(xù)灌胃給藥5 d，HS組小鼠灌胃給藥1 mg/(kg·d)，CD-L組和CD-H組小鼠分別灌胃給藥20 mg/(kg·d)，60 mg/(kg·d)，假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃給予等量生理鹽水。參照文獻(xiàn)方法[10]進(jìn)行造模。主要方法如下：4%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將小鼠仰臥固定于37℃手術(shù)臺(tái)，剃去頸部毛發(fā)，用碘伏消毒液消毒頸部皮膚，小心暴露和分離頸部左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，先結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，于頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一小口，將尼龍線由頸外動(dòng)脈剪口處插入，稍遇阻力停止推進(jìn)并固定栓線。缺血30 min，拔出尼龍線，完成再灌注，建立小鼠MCAO模型。

1.3.2 小鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分

造模24 h后，參照Longa等[11]5分制法進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。評(píng)分方法如下：無(wú)精神損傷癥狀記為0分；未能完全伸展對(duì)側(cè)前爪記為1分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈記為2分；向?qū)?cè)傾倒記為3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失記為4分，其中0分視為造模不成功，剔除。

1.3.3 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[12]的實(shí)驗(yàn)方法，具體實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分，定位航行實(shí)驗(yàn)：每次實(shí)驗(yàn)將小鼠分別從1、2、4象限中點(diǎn)放入水池，記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，即潛伏期，假如小鼠在1 min內(nèi)還沒(méi)找到平臺(tái)，需引導(dǎo)小鼠到平臺(tái)上停留20 s，并記錄其潛伏期按1 min，連續(xù)4 d。第5天撤掉平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠60 s內(nèi)通過(guò)平臺(tái)的次數(shù)以及分析小鼠尋找平臺(tái)的策略。

1.3.4 小鼠腦梗死體積測(cè)定

小鼠取血后，頸椎脫臼處死小鼠，開(kāi)顱取腦，生理鹽水沖洗干凈，-20℃冰箱內(nèi)冰凍30 min，從額極向枕極方向把腦組織作冠狀切片，厚度為2 mm，共4片，1% TTC染液37℃并避光孵育30 min，掃描儀掃描，使用Image-Pro Plus圖像分析處理軟件計(jì)算和統(tǒng)計(jì)腦梗死率，其中腦梗死率=梗死面積/總面積×100%。

1.3.5 腦水含量測(cè)定

小鼠開(kāi)顱取腦后，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，準(zhǔn)確稱量為濕重，將腦組織放入恒溫干燥箱(105℃)烤48 h，稱取腦組織為干重，腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.6 血清6-keto-PGF1α和TXB2含量測(cè)定

各組小鼠取血，4℃放置3 h，3000 r/min，離心30 min。吸取上層血清，按照試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)血清6-keto-PGF1α和TXB2含量。

1.3.7 腦組織勻漿cAMP和p-CREB的表達(dá)

BCA試劑盒檢測(cè)腦組織勻漿總蛋白濃度，加入等量樣品于電泳槽進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育cAMP(1∶2000)、p-CREB(1∶1500)一抗過(guò)夜；洗膜、孵育二抗(1∶8000)、洗膜、顯影，使用Image J軟件半定量分析各條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)二酮對(duì)MCAO小鼠行為學(xué)評(píng)分的影響

與假手術(shù)組比較，模型組、HS組和CD給藥組小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，HS組和CD給藥組行為學(xué)分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05)。與CD-L組比較，CD-H組小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

與假手術(shù)組比較，模型組、HS組和CD給藥組小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，HS組和CD給藥組行為學(xué)分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05)。與CD-L組比較，CD-H組小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。圖1 行為學(xué)評(píng)分結(jié)果Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group, cP<0.05,ccP<0.01.Figure 1 Results of behavioral evaluation

2.2 莪術(shù)二酮對(duì)MCAO小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠尋找到平臺(tái)的潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)顯著減少(P<0.01)，探索策略也多采用趨向式。與模型組比較，HS組和CD給藥組小鼠找到平臺(tái)的潛伏期均顯著降低(P<0.05)，穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)顯著增多(P<0.05)，探索策略也多采用直線式。與CD-L組比較，CD-H組小鼠找到平臺(tái)的潛伏期均顯著降低(P<0.05)，穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)顯著增多(P<0.05)，見(jiàn)表1和表2。

2.3 莪術(shù)二酮對(duì)MCAO小鼠梗死率和腦水含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦梗死率和腦含水量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，HS組和CD給藥組小鼠腦梗死率和腦含水量明顯降低(P<0.05)。與CD-L組比較，CD-H組小鼠腦梗死率和腦含水量明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2和表3。

2.4 莪術(shù)二酮對(duì)MCAO小鼠血清6-keto-PGF1α和TXB2含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清TXB2含量明顯升高(P<0.01)，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，HS組和CD給藥組小鼠血清TXB2含量明顯降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明顯升高(P<0.05)。與CD-L組比較，CD-H組小鼠血清TXB2含量明顯降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表1 各組小鼠潛伏期結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

表2 各組小鼠空間探索能力結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

表3 腦梗死率和腦水含量結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：HS組；D：CD-L組；E：CD-H組。TTC染色圖2 腦梗死體積觀察Note. A, Sham operation group. B, Model group. C, HS group. D, CD-L group. E, CD-H group. TTC stainingFigure 2 Observation of cerebral infarction volume

2.5 莪術(shù)二酮對(duì)MCAO小鼠腦組織勻漿cAMP和p-CREB表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦勻漿cAMP和p-CREB表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，HS組和CD給藥組小鼠腦勻漿cAMP和p-CREB表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與CD-L組比較，CD-H組小鼠腦勻漿cAMP和p-CREB表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

3 討論

腦缺血再灌注損傷常常會(huì)導(dǎo)致不可逆的腦組織損傷，進(jìn)而引起運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知等方面的腦功能損傷。腦缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，可能與氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[13]。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷常常可引起腦組織微循環(huán)障礙，通過(guò)抗凝藥物防治具有較好的改善作用[14]。低分子量肝素鈉是一種新型的抗凝血酶Ⅲ依賴性抗血栓形成藥，藥理作用與普通肝素鈉基本相似。但其抗凝出血傾向較弱，使用相對(duì)安全，臨床上可用于孕婦抗血栓防治[15]，故本實(shí)驗(yàn)選用低分子量肝素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照藥。莪術(shù)二酮是廣西莪術(shù)的主要有效成分之一，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有明顯抗血小板、抗炎和抗腫瘤作用等藥理作用。此外，石紅等[9]研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)二酮可顯著改善老年小鼠部分肝切除術(shù)后認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與其通過(guò)抑制海馬組織中氧化應(yīng)激，抑制NF-κB激活，減少炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的釋放有關(guān)。那么莪術(shù)二酮對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠認(rèn)知功能及神經(jīng)功能是否有較好的保護(hù)作用？這是本文章重點(diǎn)探討的問(wèn)題。

腦缺血再灌注損傷常會(huì)引起運(yùn)動(dòng)功能損傷，Longa 5分制法評(píng)分主要用于評(píng)價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的行為學(xué)分?jǐn)?shù)較假手術(shù)組有明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而給與莪術(shù)二酮后，小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且具有劑量依賴性，提示莪術(shù)二酮可明顯改善MCAO小鼠運(yùn)動(dòng)能力。Morris水迷宮是評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)、記憶能力等認(rèn)知能力的經(jīng)典方法[16]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)明顯減少，多采用趨向式的探索策略，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示模型組小鼠的認(rèn)知能力受到損害，而CD給藥組小鼠上述指標(biāo)較模型組明顯改善，呈劑量依賴性，提示莪術(shù)二酮可明顯改善MCAO的認(rèn)知能力。腦梗死率和腦組織病理學(xué)變化是評(píng)價(jià)模型成功和藥物有效的最直接簡(jiǎn)便的觀察方法[17]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腦梗死率較假手術(shù)組明顯升高，腦海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞損傷嚴(yán)重，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示造模成功。而給與莪術(shù)二酮后，小鼠腦梗死率明顯降低，腦海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有劑量依賴性。提示莪術(shù)二酮可明顯改善MCAO小鼠神經(jīng)細(xì)胞的壞死。有研究表明腦水腫是腦缺血性疾病功能障礙的主要原因，也稱為該疾病最嚴(yán)重的并發(fā)癥[18]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腦含水量較假手術(shù)組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而給與莪術(shù)二酮后，小鼠腦含水量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有劑量依賴性。提示莪術(shù)二酮可明顯減輕MCAO小鼠腦水腫程度。TXB2和6-keto-PGF1α反映機(jī)體的凝血功能的兩個(gè)指標(biāo)。它們分別是TXA2和PGI2的代謝產(chǎn)物，TXB2和6-keto-PGF1α的含量檢測(cè)可間接反映血液TXA2和PGI2的水平，而調(diào)節(jié)6-keto-PGF1α/TXB2比值對(duì)血栓形成有重要影響[19]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清TXB2含量較假手術(shù)組明顯升高，而6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明顯降低差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而給與莪術(shù)二酮后，小鼠血清TXB2含量明顯降低，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有劑量依賴性，提示莪術(shù)二酮可抑制血小板聚集，從而改善MCAO小鼠微循環(huán)障礙。研究發(fā)現(xiàn)[20-21]cAMP/CREB/BDNF 信號(hào)通路是中樞神經(jīng)維持正常生理和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、再生以及分化等有關(guān)，與學(xué)習(xí)記憶能力的形成也有密切的關(guān)系。莪術(shù)二酮給藥組可明顯升高cAMP和 CREB的表達(dá)水平，提示莪術(shù)二酮可能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、再生、分化，從而保護(hù)小鼠的認(rèn)知功能。

表4 血清6-keto-PGF1α和TXB2含量結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

注：1：假手術(shù)組；2：模型組；3：HS組；4：CD-L組；5：CD-L組。與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。圖3 各組小鼠腦組織勻漿cAMP和p-CREB Western blot電泳圖Note. 1, Sham operation group. 2, Model group. 3, HS group. 4, CD-L group. 5, CD-H group.Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group, cP<0.05,ccP<0.01.Figure 3 Western blot electrophoresis of cAMP and p-CREB in brain tissue homogenization of various groups

綜上所述，莪術(shù)二酮對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠認(rèn)知功能及神經(jīng)功能有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低TXB2含量，升高6-keto-PGF1α、6-keto-PGF1α/TXB2比值、cAMP和 CREB的水平，從而改善MCAO小鼠微循環(huán)障礙以及激活cAMP/CREB/BDNF信號(hào)通路有關(guān)。