煙草疫霉菌LAMP檢測方法的建立及驗證

吳娜 李淑君 康業斌

摘? 要：為了建立煙草疫霉菌（Phytophthora parasitica）可視化快速檢測方法，試驗以羥基萘酚藍（HNB）為指示劑，以煙草疫霉菌特異的核糖體轉錄間隔區（Internal transcribed spacer，ITS）為目的DNA片段，應用LAMP設計軟件設計4條引物，通過優化LAMP反應體系和反應條件，建立一種準確快速的LAMP檢測方法，并對該檢測方法的特異性、靈敏度及實際應用效果進行驗證。結果表明，本試驗建立的煙草疫霉菌LAMP反應體系具有較好特異性且靈敏度較高。特異性檢測只有煙草疫霉菌株LAMP產物為陽性（藍色），且電泳結果能夠產生梯形條帶;靈敏度驗證在DNA水平上可達到100 fg，是普通PCR檢測方法的1000倍。對田間疑似黑脛病病株及其根際土樣提取的DNA進行LAMP檢測，各有3份樣本為陽性，且病株檢測結果與組織分離法對煙草疫霉的檢測結果相一致;接種2 d后，病害癥狀還不明顯的煙株中即可檢測到煙草疫霉菌。本研究建立的煙草疫霉LAMP檢測體系，可快速、簡捷地檢測到病株及其攜帶土壤中的煙草疫霉菌。

關鍵詞：煙草疫霉菌;煙草黑脛病;環介導等溫擴增（LAMP）;羥基萘酚藍（HNB）

Establishment of the Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for Detection ofPhytophthora parasitica

WU Na¹， LI Shujun²， KANG Yebin^1*

（1. College of Forestry， Henan University of Science and Technology， Luoyang， Henan 471023， China; 2. Xuchang Tabocco Research Institute， Henan Academy of Agricultural Science， Xuchang， Henan 461000， China）

Abstract： In order to establish a rapid detection method forPhytophthora parasitica， hydroxynaphthol blue （HNB） was used as an indicator for thePhytophthora nicotianaspecific transcribed spacer （ITS） DNA sequence. The primers were designed with the LAMP design software. The LAMP reaction system and reaction conditions were optimized and? the specificity， sensitivity and practical application of the detection method were verified. The results showed that the LAMP reaction system ofPhytophthora nicotianaeestablished in this experiment has good specificity and high sensitivity. Specific detection showed that only the LAMP product of thePhytophthora nicotianastrain is positive （blue）， and the electrophoresis can produce trapezoidal bands. The sensitivity verification can reach 100 fg at the DNA level， which is 1000 times of the detection sensitivity of the common PCR method. The LAMP test was carried out on the DNA extracted from the suspected black smut disease strain and its rhizosphere soil samples， and each of the three samples were positive， and the test results of the diseased plants and the tissue separation method were consistent with the detection results ofPhytophthora nicotianae. After 2 days of inoculation，Phytophthora nicotianaecan be detected in tobacco plants with no obvious symptoms of tripping. ThePhytophthora nicotianaLAMP detection system established in this study can quickly and easily detect thePhytophthora nicotianaein the diseased plants and their carrying soil.

Keywords：Phytophthora parasitica; tobacco black shank; LAMP; HNB

煙草疫霉菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）為鞭毛菌亞門（Mastigomycotina）卵菌綱（Oomycota）、疫霉屬（Phytophthora）的一種土傳植物病原菌^[1]，由該菌侵染煙株引起的黑脛病是煙草的毀滅性病害之一，且該菌常與其他土傳病菌如根黑腐病菌（Thielaviois basicola）、立枯病菌（Rhizoctonia solani）、腐霉菌（Pythium phanidermatum）等混合侵染，田間發病癥狀相似，病害診斷困難^[2]。傳統的煙草病害診斷方法是對具有典型癥狀的病樣進行分離、鑒定，其耗時長、靈敏度低，易受人為及環境等諸多因素干擾^[3]。因此，建立快速、準確的煙草疫霉菌檢測方法已成為生產中迫切需要解決的問題。目前煙草疫霉菌的分子檢測方法主要以普通PCR和熒光定量PCR為主^[4-5]，這些方法操作復雜、費時費力，而且需要特殊的儀器設備，無法滿足基層檢測的需求。環介導等溫擴增技術（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）是NOTOMI等^[6]于2000年開發的一種快速、簡便、廉價、新型的恒溫核酸擴增技術。該技術針對靶基因的6個區域設計4條特異引物（2條外引物和2條內引物），利用鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒溫條件下高效、快速、特異地擴增靶序列;LAMP反應產物可通過SYBR Green I、鈣黃綠素和羥基萘酚藍（HNB）等^[7-8]顯色劑染色后顏色變化來判斷，可方便、直觀地獲取反應結果;目前該技術已成功應用于燕麥鐮孢菌^[9]、尖孢鐮孢菌^[10]、柑桔潰瘍病菌^[11]、煙草環斑病毒^[12]、香蕉穿孔線蟲^[13]等植物病原物的檢測。有關LAMP技術在煙草疫霉菌檢測方面的報道較少，王勇等^[14]、陳慶河等^[15]利用SYBR Green I顯色劑建立了煙草疫霉菌的LAMP技術檢測體系，但SYBR Green I顯色劑需要在反應結束后開管添加，此時反應產物容易產生氣溶膠污染，導致檢測結果不穩定^[16]。因此，本研究選擇羥基萘酚藍（HNB）做顯色劑，且在反應液中提前加入HNB，以煙草疫霉特異的核糖體轉錄間隔區（ITS）為目的DNA片段，設計4條引物，建立了LAMP檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏度、田間及接種病株的應用效果進行評估，以期為煙草疫霉菌的快速檢測提供技術支撐。

1 ?材料與方法

1.1? 供試菌株

煙草疫霉菌（Phytophthora parasitica）與對照菌株立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、根串珠霉（Thielaviopsis basicola）、茄病鐮刀菌（Fusarium solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatm）、固執腐霉（Pythium recalcitrans）、二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）、鏈格孢菌（Alternaria alternata）、致病疫霉（Phytophthora infestans）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、大豆疫霉（Phytophthora sojae）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）均來自于河南科技大學植物病害分子鑒定與綠色防控實驗室。

1.2? 菌株培養及基因組DNA的提取

將致病疫霉（Phytophthora infestans）轉至黑麥培養基^[17]，辣椒疫霉（Phytophthora capsici）轉至燕麥培養基（OA）^[18]，其他菌株轉至馬鈴薯葡萄糖固體培養基（PDA）培養4 d后，從菌落邊緣切取相應菌絲塊，致病疫霉菌株轉至黑麥液體培養基，辣椒疫霉轉至燕麥液體培養基，其他菌株轉至馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，培養至菌絲體長滿培養皿。病原菌總DNA的提取采用CTAB法^[19]提取。采用植物基因組DNA快速抽提試劑盒（生工生物工程有限公司編號：B518231）進行煙草組織DNA的提取。沒有發病的健康植株用作對照的煙株。提取的DNA保存在?20 ℃冰箱中備用。

1.3? 病原菌ITS序列的擴增及LAMP引物的設計

從GeneBank中下載煙草疫霉菌的ITS基因序列和其他疫霉種的ITS基因序列，利用MEGA軟件對所有下載的ITS基因序列進行比對分析，并使用在線應用軟件Primer Explore V5 （http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html），根據LAMP引物篩選原則篩選出一套特異性檢測引物。其中，F3/B3為外引物，FIP/BIP為內引物，其序列見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，將合成好的引物放入D2012 Plus型臺式高速離心機（北京大龍興創實驗儀器有限公司），4000 r/min離心1 min，使吸附于離心管壁的引物沉到離心管底部。根據引物管壁標簽的說明，首先用ddH₂O將引物配制成100 μmol/L的保存液，?20 ℃冰箱保存備用。使用前再將保存液稀釋至試驗時所使用的濃度。

1.4 ?LAMP反應體系的優化與建立

試驗參考Bst DNA polymerase推薦體系（dNTP 1.6 mmol/L，MgSO₄6 mmol/L，FIP/BIP各1.6 μmol/L，F3/B3各0.2 μmol/L，Bst DNA polymerase 320 U/mL，加2.5 μL的10×ThermoPol Buffer，1 μL模板DNA，滅菌水補至25 μL。64 ℃恒溫孵育1 h。）及相關文獻^[8-12]，通過單因素變化對LAMP反應體系的各參數，包括HNB[源葉生物科技（上海）有限公司]與dNTP[生工生物工程（上海）股份有限公司]、Bst DNA聚合酶與硫酸鎂[威展生物科技（鄭州）有限公司]進行優化。本試驗選用HNB作為指示劑，若目的序列發生擴增，則反應液呈藍色（陽性反應），反之反應液呈紫色（陰性反應），最后用2.0%瓊脂糖凝膠電泳再次驗證擴增結果，陽性反應產生階梯狀條帶，陰性反應則無此現象。設置3次重復。

1.5 ?LAMP引物特異性檢測

根據已優化的反應體系對所有供試菌株進行特異性檢測，通過肉眼觀察檢測結果，藍色為陽性，紫色為陰性;并用2.0%瓊脂糖凝膠電泳加以驗證。設置3次重復。

1.6 ?LAMP檢測靈敏度測定

用紫外分光光度計檢測煙草疫霉DNA濃度后，按10倍梯度（10^-1～10^-7）稀釋為100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL，分別取1 μL各梯度DNA稀釋液以進行快速LAMP擴增和普通PCR，比較LAMP檢測法和普通PCR檢測法對煙草疫霉的檢測靈敏度差別。普通PCR反應引物使用基于ITS基因靶標設計的煙草疫霉菌特異性引物F3/B3。普通PCR反應的混合液總體積為25 μL，包括：相應濃度的模板DNA，2×Taq Gold Master Mix Buffer 12.5 μL，F3/B3 0.5 μmol/L，ddH₂O 9 μL，PCR儀上完成反應。反應程序：94 ℃預變性3 min;然后進入循環，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環;最后72 ℃延伸7 min。反應結束后取5 μL擴增產物于1.0 %瓊脂糖凝膠中電泳1 h（80 V），在凝膠成像系統上檢測并拍照。LAMP檢測結果直接用肉眼觀察，藍色為陽性，紫色為陰性;并用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。設置3次重復。

1.7 ?田間病株與病土中煙草疫霉檢測

從洛陽市宜陽縣煙田采集具有煙草黑脛病疑似癥狀的病莖樣本5份，提取樣本總DNA，各取1 μL DNA用于LAMP檢測，同時對病株發病部位按照常規組織分離法進行病菌分離驗證。設置3次重復。

取上述5株疑似病株根際土壤5份，提取土壤樣本總DNA，取1 μL DNA用于LAMP檢測，檢測結果與病株檢測結果相比較。設置3次重復。

1.8? 接種植株發病組織中煙草疫霉檢測

選長勢良好的感黑脛病煙草品種長脖黃（6～7片葉），用無菌注射器刺傷莖部表皮，在針刺部位接種菌齡7 d煙草疫霉菌絲塊（直徑為5 mm），用脫脂棉蘸取無菌水包裹保濕，以接種空白瓊脂塊的為對照。在接種1、2、3 d后分別取接種部位莖部組織約100 mg，提取植物侵染部位的總DNA，利用LAMP方法進行檢測。設置3次重復。

2 ?結? 果

2.1 ?LAMP反應體系的優化與建立

2.1.1? HNB濃度的優化? 圖1A顯示，HNB在0.1～0.2 mmol/L 6個不同的濃度下反應液均變為藍色，顏色逐漸變亮，確定0.2 mmol/L為HNB反應濃度;由圖1B顯示，HNB濃度在0.1～0.2 mmol/L時電泳條帶差異不顯著。

2.1.2? dNTP濃度的優化? 如圖2A所示，dNTP在1.0～1.6 mmol/L 4個不同的濃度下反應液均變為藍色，且顏色逐漸變深，當dNTP濃度為1.4 mmol/L時，反應液顏色最亮，確定1.4 mmol/L為dNTP反應濃度;dNTP濃度在1.0～1.6 mmol/L時電泳條帶差異不顯著（圖2B）。

2.1.3? 硫酸鎂濃度的優化? 硫酸鎂在3～7 mmol/L 5個不同的濃度下反應液均變為藍色（圖3A），顏色差異不顯著，通過參考Bst DNA polymerase推薦體系[威展生物科技（鄭州）有限公司]及相關文獻^[8-12]，確定6 mmol/L為硫酸鎂反應濃度;硫酸鎂濃度為3～7 mmol/L時電泳條帶差異不顯著（圖3B）。

2.1.4? Bst DNA酶濃度的優化? Bst DNA酶在240～ 320? U/mL 2個不同的濃度下反應液均變為藍色（圖4A），顏色逐漸變深，確定320 U/mL為Bst DNA酶反應濃度;Bst DNA酶濃度在320 U/mL時電泳條帶最亮（圖4B）。

結合試驗優化結果及參考Bst DNA polymerase推薦體系[威展生物科技（鄭州）有限公司]及相關文獻^[8-12]，優化后的最終反應體系各組分最佳濃度為：dNTP 1.4 mmol/L，MgSO₄6 mmol/L，HNB 0.2 mmol/L，FIP/BIP各1.6 μmol/L，F3/B3各0.2 μmol/L，Bst DNA polymerase 320 U/mL，加2.5 μL的10×ThermoPol Buffer，1 μL模板DNA，滅菌水補至25 μL。將上述25 μL反應體系置于0.2 mL的PCR反應管內，輕微渦旋后將反應管置于PCR儀上完成反應。反應程序：64 ℃擴增60 min，80 ℃退火10 min。

2.2 ?引物特異性檢測

如圖5A所示，在HNB指示劑的作用下，只有煙草疫霉LAMP檢測顯示藍色;電泳結果顯示（圖5B）擴增產物出現特有的梯形條帶，而其他供試菌株中均沒有觀察到這些現象。說明LAMP引物對檢測煙草疫霉具有很好的特異性。

2.3 ?LAMP檢測靈敏度

LAMP檢測結果在以100 fg/μL DNA為模板時，反應產物可顯示藍色（圖6A）。取5 μL LAMP產物用2.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，從100 ng/μL至100 fg/μL的模板DNA都可以出現LAMP產物特有的梯形條帶（圖6B），說明該LAMP反應體系可以檢測到100 fg的煙草疫霉基因組DNA。普通PCR以F3/B3為引物，模板DNA濃度在100 ng/μL至100 pg/μL時均可得到有效的擴增（圖6C），表明其檢測的靈敏度為100 pg/μL。LAMP檢測靈敏度比普通PCR提高1000倍。

2.4 ?田間病株與病土中煙草疫霉LAMP檢測

通過對5份疑似煙草黑脛病病株的DNA檢測發現，3份為陽性，2份為陰性（圖7A）。病樣經常規組織分離與分離物形態學觀察鑒定，僅陽性病樣的分離物鑒定為煙草疫霉。5份疑似病株根際土壤的DNA檢測發現，3份為陽性，2份為陰性（圖7B），根際土壤檢測結果與煙株檢測結果一致。證實了本研究建立的LAMP檢測體系對煙草疫霉菌具有特異性。

2.5 ?接種植株發病組織中煙草疫霉LAMP檢測

感黑脛病品種長脖黃接種1 d后，接種部位無明顯癥狀;2 d后接種部位縊縮，有少量褐色或黑色壞死斑，病斑不擴展;3 d后接種部位明顯縊縮，莖部有褐色或黑色壞死，并上、下擴展。接種2 d、3 d后的煙株，接種部位莖部組織均可檢測到煙草疫霉（圖8A、B）。證實本研究建立的LAMP檢測體系對煙草疫霉菌具有很高的靈敏性，可用于黑脛病的早期診斷。

3 ?討? 論

試驗基于真菌ITS序列設計出一套用于檢測煙草疫霉的LAMP特異性引物，并對反應條件及反應試劑使用濃度進行了優化，建立了煙草疫霉LAMP檢測體系。

本研究利用HNB建立的煙草疫霉LAMP技術體系可以檢測到100 fg的煙草疫霉基因組DNA，檢測靈敏度比普通PCR提高1000倍;比劉萍花等^[20]建立的多重PCR檢測黑脛病菌靈敏度提高了100倍;比王勇等^[14]利用SYBR Green I建立的煙草疫霉快速檢測體系靈敏度提高了10倍，是陳慶河等^[15]利用SYBR Green I建立的煙草疫霉快速檢測體系靈敏度的0.1倍。趙賽^[21]報道在優化濃度范圍內，隨著dNTP濃度的加大，反應條帶越來越清晰。本研究發現，對反應靈敏度影響最大的體系成分為dNTP，在優化濃度范圍內，隨著dNTP濃度增加，反應液變化的顏色加深。此外，不同體系靈敏度產生的差異還與引物設計、染色劑種類等因素有關。

在大田實際應用中，本研究建立的LAMP檢測方法，所得的檢測結果與組織分離結果一致。較傳統組織分離鑒定植物病原物，LAMP技術更具有便捷、快速不受人為因素影響等優點，且不受植物組織浸出液干擾^[22]，這對生產上診斷和防治煙草疫霉菌引起的相關病害具有重要的應用價值。人工接種的結果證明，病菌侵入煙株2 d，在煙株猝倒癥狀還不明顯時即可被檢測到標靶菌，這對于田間煙株早期檢測、病害早期預防有重要的實用價值。

4 ?結? 論

本研究建立的煙草疫霉LAMP檢測體系，能夠快速、準確地從煙株發病組織及其根際土壤中檢測出煙草疫霉，這對制定煙草黑脛病的田間監測和指導防治具有重要的意義。

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