丁苯酞減輕小鼠腦缺血再灌注損傷

張勝龍，秦歷杰，彭海林

(1.河南省人民醫院急診科，河南 鄭州；2.鄭州大學人民醫院，河南 鄭州)

0 引言

腦卒中是致死、致殘率高的世界難題，全球致死疾病排行第二，我國致死疾病排行甚至超過心血管病排行第一[1]。最常見的典型缺血性腦卒中是由大腦中動脈栓塞引起。目前缺血性腦卒中最有效治療方案包括溶栓和血栓抽吸，不僅受時間窗的限制還存在諸多禁忌癥。丁苯酞是我國自主研制的新藥，能通過多種途徑發揮保護缺血再灌注損傷作用[2]。目前國內外對于其作用靶點和機制尚未闡明，而該藥上市時間較短，臨床上對藥物的研究方法和干預措施有限，因此有必要通過動物模型試驗探討該保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品和主要試劑

雄性、體重為26-28g的野生型C57BL/6小鼠，SPF級，武漢大學模式動物中心提供。丁苯酞注射液（恩必普）。凋亡蛋白抗體（購自 Cell Signaling Technology）。

1.2 小鼠分組及模型

使用2.0%的異氟烷和氧/氧化亞氮混合氣體吸入麻醉小鼠，75%醫用酒精濕潤頸部鼠毛，剔除鼠毛。剪去左顱頂部鼠毛，酒精擦拭，在顱頂部行縱向切口，暴露顱骨，剝離顱骨表面結締組織。將激光多普勒血流儀的光纖探頭用生物膠固定在前囟后方1.5mm、距離顱骨中縫3-4mm的部位。翻轉小鼠使其處于仰臥位并固定，將光纖從鼠板的凹槽中傳出，連接到激光多普勒血流儀，記錄初始狀態的腦血流灌注量，插入肛溫探頭，保持體溫在37±0.5℃。行頸部正中切口，暴露左側頸總動脈，頸內動脈和頸外動脈。使用8-0絲線結扎頸外動脈遠心端，在頸外動脈穿入另一根8-0絲線，在靠近頸總動脈分叉處打一個活結。使用動脈夾分別夾閉頸內動脈、勁總動脈。在距離頸外動脈結扎線下1mm處剪一個小口，將一根602156號硅膠線栓從小口中插入。松開頸內動脈夾，在小口處剪斷頸外動脈，回抽線栓、反轉使其進入頸內動脈，并向內插入willis環-大腦中動脈段，線栓的插入深度距離頸總動脈分叉處約9±1mm，稍微系緊活結。此時激光多普勒血流儀檢測到的血流量下降75%以上。缺血45min后拔掉線栓，結扎外動脈近心端，松開動脈夾，大腦血流再灌注，縫合傷口，常規飼養。建模成功后隨機分為丁苯酞組和對照組。丁苯酞組每天腹腔注射丁苯酞注射液4.5mg/kg 1次，對照組每天腹腔注射等量的生理鹽水，持續常規喂養2周。

1.3 鼠神經功能評分及TTC染色

基于Berderson評分改進方法（9分制）。0分：無神經受損的癥狀；1分：提尾時對側前肢蜷曲，或者不能完全到達患側前肢；2分：提尾時對側肩膀內收；3分：平推：向對側推動時阻力下降；4分：可自發的向各個方向運動，但在脫尾巴時只向對側轉彎；5分：自發運動時轉圈或只向對轉；6分：無自主運動，只在刺激時運動；7分：無自主運動，刺激時也無運動；8分：與腦缺血有關的死亡。評分完成后，用3%戊巴比妥鈉對小鼠腹腔注射0.07mL麻醉小鼠，沿正中線充分暴露心臟，用0.55號頭皮針連一次性輸液器，灌注4℃ PBS緩沖液進行灌流，之后用4%多聚甲醛溶液灌流8min，以固定血管內膜面，取腦組織。

將腦組織于-20℃冰箱冷凍30min，用刀片切成1mm厚的切片，切7片（前囟前方切4片，后方切3片）。將切片立即置于10mL 2%TTC的血清瓶中，37℃恒溫孵育10min。不時翻動腦片，使組織均勻染色。正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區呈蒼白色。

1.4 RT-PCR檢測

采用TRizol （15596-026, Invitrogen）試劑提取組織中的mRNA， 使 用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（04896866001, Roche, Basel, Switzerland）反轉錄試劑盒，根據試劑盒說明書進行反轉錄實驗。之后利用SYBR Green PCR Master Mix （04887352001, Roche）進行PCR擴增，以β-actin的表達為內參對目標基因的mRNA表達水平進行歸一化。

1.5 統計學方法

統計軟件采用SPSS 21.0，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05有統計學意義，P＜0.01差異非常顯著。使用Image Pro Plus （version 6.0）軟件進行梗死面積百分比統計結果代替梗死體積百分比。梗死體積百分比=梗死面積百分比=（（第一片梗死面積+倒數第二片梗死面積）/2+剩余各片梗死面積）/對側7片面積和。

2 結果

2.1 丁苯酞組Bederson神經功能評分更低

兩周后丁苯酞組12只小鼠普遍提尾時對側肩膀有內收功能，對照組12只小鼠向對側推動時阻力明顯下降，丁苯酞組神經評分均值為2.4，對照組均值為3.4，兩組間t=4.464，P=0.000，見Fig1A。

2.2 丁苯酞組TTC染色梗死體積百分比更少

2周后TTC染色，白色提示梗死區，紅色提示正常腦組織色，梗死區位于皮層和紋狀體，對照組梗死體積百分比均值為17.7%，丁苯酞組梗死體積百分比均值為6.5%，兩組間t=4.878，P=0.005，見Fig1B。

圖1 丁苯酞神經功能保護作用（A）丁苯酞組與對照組改良Bedserson評分（9分制）（B）丁苯酞組和對照組腦組織切片TTC染色，紅色區域為正常腦組織，白色為梗死腦組織，柱狀圖為梗死面積(體積)百分比（＊＊ P＜0.01）

2.3 丁苯酞組抑制凋亡的基因表達上調，凋亡基因的表達下調

2周后，丁苯酞組相對于對照組，丁苯酞組抑制凋亡的基因表達上調，丁苯酞組Bcl-2相對表達量1.98，t=-9.052，P=0.000，Bcl-xl相對表達量為1.54，t=-4.892，P=0.003，凋亡基因表達下調，丁苯酞組Bax相對表達量為0.43，t=6.920，P=0.003，Bad相對表達量為 0.57，t=7.458，P=0.000，Bid相對表達量為 0.53，t=6.335，P=0.001。

圖2 RT-PCR測凋亡相關基因mRNA相對量比較。（＊ P＜0.05，＊＊P＜0.01）

3 討論

丁苯酞在缺血性腦卒中的治療中效果肯定，但是關于丁苯酞的治療機制并未完全研究清楚。目前對于缺血再灌注損傷的機制研究包括興奮性氨基酸毒性，線粒體損傷，炎癥反應，鈣超載，抗自由基，抗細胞凋亡等[3]。在缺血中心區，血流低于正常水平的10-25%，將會發生不可逆性神經細胞壞死，在缺血半暗帶，存在廣泛的炎癥反應，能進一步刺激小膠質細胞，產生更多的炎癥因子，能量的缺乏，酸性毒性物質進一步積累，都會使缺血半暗帶神經細胞凋亡[4,5]，神經細胞的壞死過程不可逆，但是凋亡過程可以通過調控上游信號進行逆轉[5]。因次逆轉缺血半暗帶細胞的凋亡是減少腦缺血再灌注損傷重要的調控機制。

凋亡進程分為三期，誘導期細胞接受不同信號產生效應，效應期由Bcl-2家族等調控分子使細胞進入不可逆的程序性死亡，降解期可見細胞凋亡。凋亡發生是凋亡相關基因表達的結果，同時受到鈣超載、氧自由基、線粒體等內外因素的調節[6]。Bcl-2基因最早發現[7]于B淋巴濾泡細胞染色體易位斷點t（14；18），Bcl-2蛋白家族按功能分為抑制凋亡蛋白和促凋亡蛋白。大多數定位線粒體外膜，或受到刺激后轉移到線粒體外膜。Bcl-2，Bcl-xl含有4個BH結構域，屬于抗凋亡蛋白家族成員，多數缺血再灌注損傷保護的研究發現他們的表達往往是上調的。Pan等研究[8]發現通過激活pi3k/akt/mtor生存途徑減少線粒體中bcl-2/rac1復合物的形成，從而抑制體內腦缺血再灌注損傷和體外高葡萄糖誘導的PC-12細胞神經毒性的缺血再灌注后腦損傷。Song,DD等研究鞘氨醇激酶2通過BH3結構域與Bcl-2相互作用，可以激活自噬并抵抗小鼠原代神經元細胞氧葡萄糖剝奪引起的細胞損傷[9]。Dixon, BJ在大鼠幼崽接受單側頸動脈結扎缺氧誘導神經元損傷后，發現IFNβ通過刺激STAT3和Bcl-2過表達，導致caspase-3的表達減少[10]。Bid、Bad屬于僅含BH3結構域的促凋亡蛋白成員，是細胞凋亡啟動子和抗凋亡蛋白家族的拮抗劑，調控他們基因表達下調可以保護缺血再灌注損傷。Talebi等研究[11]雷帕霉素在大鼠MCAO模型中mTOR信號通路時發現，雷帕霉素治療可改善缺血后梗死體積，神經功能缺失，腦水腫和血腦屏障通透性，可能通過降低Mir-1基因表達，從而降低靶基因Bad的表達保護缺血再灌注后腦損傷。Bax屬于Bax亞家族促凋亡蛋白成員，含有3個BH結構域，通過調節線粒體外膜穩定性允許凋亡因子釋放到細胞質促進凋亡[12]。

Bcl-2家族蛋白相互作用對腦缺血再灌注損傷的研究表明可能是細胞應激后僅含BH3的Bid、Bad等啟動細胞凋亡程序，拮抗Bcl-2、Bcl-xl等抗凋亡蛋白，并激活Bax亞家族成員。激活的Bax從胞質內轉移到線粒體外膜，并與膜上的電壓依賴陰離子通道作用，通道開放使線粒體內凋亡因子細胞色素C等釋放到細胞質，引起細胞凋亡[13]。很多研究已經表明通過抗凋亡基因表達的上調和促凋亡基因表達的下調可以保護腦缺血再灌注損傷。

丁苯酞注射液腹腔注射兩周后，促凋亡基因Bax、Bid、Bad的表達明顯下調，抗凋亡基因Bcl-2、bcl-xl表達明顯上調，由此推測丁苯酞注射液參與了凋亡基因的表達過程，其保護缺血再灌注腦損傷的具體靶點和調控機制需要進一步來研究。

4 結論

丁苯酞能減輕急性期腦缺血再灌注損傷，可能與上調抑制凋亡基因表達和下調促凋亡基因表達有關。