DNK-A400全自動微生物聯合檢測儀檢測真菌1-3-β-D葡聚糖和曲霉半乳甘露聚糖的性能評價

張雨虹，王云英

(重慶醫科大學附屬第二醫院，重慶)

0 引言

臨床上侵襲性真菌病（Invasive fungal disease，IFD）感染率和致死率不斷增高，真菌感染的早期診斷和治療可顯著降低患者死亡率[1-2]。IFD的傳統檢測方法主要為真菌鏡檢、各種培養基培養鑒定、組織病理學診斷，但存在耗時長、成本高昂、工序復雜等缺點[3]。1-3-β-D 葡聚糖（1-3-β-DGlucan, G）實驗及曲霉半乳甘露聚糖（Galactomannan, GM）實驗可以對IFD進行快速診斷，已成為IFD早期檢測的重要手段之一，被列入真菌診斷和治療指南[4]。由此，重慶醫科大學附屬第二醫院引進了基于G實驗與GM實驗的儀器設備，對患者進行真菌快速診斷。研究使用新購進的丹娜生物DNK-A400全自動微生物聯合檢測儀分別進行G實驗和GM實驗，驗證儀器精密度、正確度、線性范圍及抗干擾等指標，進行綜合性能評價。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

于川大華西醫院收集G實驗陽性、陰性血清樣本各10例，重醫附一院GM實驗陽性、陰性血清樣本各10例，一次性無菌無熱原真空采血管按標準方法采取靜脈血4mL，3000 r/min離心10min，收集血清。精密度驗證采用多個不同濃度的血清相互混勻，設置為高、低兩個濃度；正確度實驗樣本為以上兩所醫院提供的帶有原始結果數據的留存樣本；線性范圍驗證使用高、低濃度標準品按一定比例配成為指南設計最高/最低檢測范圍內不同濃度梯度的六個樣本；干擾評價采用含有高水平膽紅素的黃疸血清分別與陽性和陰性標本按照 1：9、3：7、1：1三種不同比例混合，以設置為高、中、低程度的干擾[5]。

1.2 儀器與材料

儀器：丹娜生物DNK-A400全自動微生物聯合檢測儀，以及金屬浴孵育器、漩渦混合器、高速離心機（10000r/min）。

材料：廠商提供的G實驗、GM實驗所用試劑盒材料，內含反應主劑、處理液、標準品、質控品、溶解液及主劑復溶液。

1.3 檢測方法

參照全國臨床檢驗操作規程，嚴格按照儀器的操作規程和試劑說明書操作，在室內質量控制結果允許范圍內對樣本進行檢測。由DNK-A400全自動微生物聯合檢測儀自動化完成精密度、正確度、線性范圍及干擾因素實驗所需數據的測量。通過參考G實驗與GM實驗的相關指南及各類報道發現：目前該兩種實驗儀器的性能評價尚無統一的標準規則[6-8]。因此，對于實驗數據的判定方法參照《GBT 26124-2011臨床化學體外診斷試劑（盒）》國家標準與《YYT 1183-2010 酶聯免疫吸附法試劑（盒）》行業標準進行。方法如下：

1.3.1 精密度驗證

將高、低兩個濃度的樣本每天連續檢測5次，持續檢測3天，用得出的15組數據，計算精密度（cv%）；若CV值不超過10%，則精密度驗證通過[9]。

1.3.2 正確度驗證

G實驗以川大華西醫院丹娜檢測結果作為對照，GM實驗以重醫附一院伯樂檢測結果作為對照，在DNK-A400全自動微生物聯合檢測儀上對樣本進行檢測，每個樣本測試1次，用卡方檢驗評價兩者結果的一致性[10]。

1.3.3 線性范圍

在試劑說明書的線性范圍兩端選取高、低濃度的兩份標準品，為高值（H）樣本和低值（L）樣本，按 5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L、5L配置成6個濃度梯度的樣本，每個樣本重復檢測2次，計算平均值。將理論值和實測值進行線性回歸，計算線性相關系數r2；若G實驗r2＞0.99，GM實驗r2＞0.98，則表明線性關系良好，可接受其分析測量范圍[11]。

1.3.4 干擾實驗

采用添加外源性膽紅素的方式進行抗干擾實驗，將高水平膽紅素的黃疸血清分別與陽性和陰性樣本按照1：9、3：7、1：1三種不同的比例混合，檢測其濃度，計算檢測濃度與理論濃度間的偏倚（%），作為干擾率，以干擾率≤10%作為是否存在明顯干擾為判斷標準[12]。

1.4 統計學方法

所有數據使用Microsoft office Excel和SPSS 17.0軟件進行處理。

2 結果

2.1 精密度驗證

DNK-A400全自動微生物聯合檢測儀進行G、GM實驗，G實驗高、低兩個濃度樣本精密度分別為6.78%、7.85%， GM實驗高、低兩個濃度樣本精密度分別為7.53%、9.83%，均低于試劑盒的精密度指標，符合臨床要求（見表1、表2）。

表1 G實驗精密度評估結果（n=15）

表2 GM實驗精密度評估結果（n=15）

2.2 正確度驗證

檢測G實驗陽性、陰性樣本各10例，DNK-A400全自動微生物聯合檢測儀檢測的定性結果與川大華西醫院陽性值符合率90%，陰性值符合率為90%；檢測GM實驗陽性、陰性樣本各10例，其定性結果與重醫附一院伯樂的陽性值符合率90%（P＞0.05），陰性值符合率為90%（P＞0.05），均符合廠商指標（見表3、表4）。

表3 G實驗正確度評估結果（n=20）

表4 GM實驗正確度評估結果（n=20）

2.3 線性范圍驗證

根據G實驗和GM實驗的樣本結果分別制定了回歸曲線（見圖1、圖2），可以看出，G實驗線性相關系數r2＞0.99，GM實驗線性相關系數r2＞0.98，數據呈線性關系，線性良好；驗證的G實驗和GM實驗分析測量范圍分別為 38.8～606.680pg /mL、0.351～4.292ug/L，與廠商指標37.5-600pg/mL、0.25-5ug /L相近，可以接受廠商的分析測量范圍（見表5）。

圖1 G實驗濃度與OD值線性關系

圖2 GM試驗濃度與OD值線性關系

表5 G實驗及GM實驗線性范圍評估結果

表6 G實驗干擾因素驗證結果（n=8）

表7 GM實驗干擾因素驗證結果（n=8）

2.4 干擾因素驗證

將含高水平膽紅素的黃疸血清按一定比例分別與G實驗、GM實驗陽性和陰性樣本混合成高、中、低程度干擾樣本，檢測后計算其干擾率，以干擾率≤10%作為評價標準，進行性能驗證。結果顯示G實驗高濃度干擾范圍為-45.58%-41.25%，中濃度干擾范圍為-31.36%-39.68%，低濃度干擾范圍為-9.42%-9.63%，GM實驗高濃度干擾范圍為-11.03%-11.46%，中濃度干擾范圍為-10.44%-9.70%，低濃度干擾范圍為-9.22%-8.54%，表明G實驗在低濃度膽紅素干擾下影響較小，GM實驗在高、中、低濃度膽紅素干擾下影響輕微，干擾率基本低于10%（表6、表7）。

3 總結與討論

DNK-A400全自動微生物聯合檢測儀是丹娜生物公司提供的一款自動化侵襲性真菌檢測設備，具有操作簡便、重復性和穩定性好、適用性強和抗干擾能力強的特點。然而，不同實驗室溫度、濕度、水質及人員操作習慣等檢測條件有很大差異。因此，按照IS015189“醫學實驗室質量和能力的專用要求”的規定，設備應在安裝及常規使用中顯示出能夠達到規定的性能標準，并且符合相關檢驗所要求的規格。

精密度是檢測中最基本的性能指標，本研究驗證了丹娜生物DNK-A400全自動微生物聯合檢測儀在G實驗、GM實驗精密度分別為6.78%～7.85%、7.53%～9.83%，精密度良好，表明該儀器在本實驗室檢測環境中系統重復性符合要求，符合臨床檢驗的質量要求。

正確度為若干次測量結果平均數與定值的質量控制品或校準品進行對比，所得出的準確程度。因目前G、GM檢測無公認的參考物質，也無合適的室間質評材料。因此采用將G實驗所測結果與川大華西醫院檢測結果進行對比，GM實驗與重醫附一院伯樂檢測結果進行對比，通過陰陽性符合率來評估儀器正確度。本次檢測中陰性、陽性符合率均達到90%，符合該儀器檢測系統正確度性能要求。

線性范圍評價表明，G實驗線性相關系數r2為0.9999，GM實驗線性相關系數r2為0.9854，符合線性關系。因此可以接受廠商提供的37.5-600pg /mL、0.25-5ug /L分別作為G實驗、GM實驗分析測量范圍。

因本所醫院感染科病人極多，黃疸病人的血清中膽紅素無法祛除，因此設計膽紅素干擾實驗，以驗證其性能。干擾結果表明，G實驗在低濃度膽紅素干擾下影響較小，GM實驗在高、中、低濃度膽紅素干擾下影響輕微。我們猜測是由于G實驗是通過動態顯色法檢測血清中的真菌1-3-β-D葡聚糖，膽紅素血清中色素無法祛除，對其有一定干擾；GM實驗是通過酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清中的曲霉半乳甘露聚糖，膽紅素血清對其影響輕微。

丹娜生物DNK-A400全自動微生物聯合檢測儀進行G實驗、GM實驗檢測侵襲性真菌的方法學性能良好，性能評價所有項目均能夠基本達到預期，能為臨床快速提供準確、可靠的檢驗結果，能夠滿足急診檢驗工作的需要，對侵襲性真菌的早期診斷和臨床用藥具有重要意義。