1,6-二磷酸果糖三鈉鹽的毒理學研究

郭婉，王穎艷，張彪

（張家港市華天藥業有限公司，江蘇 張家港）

0 引言

1,6-二磷酸果糖三鈉鹽（Fructose 1,6-diphosphate trisodium salt），簡稱FDP，是糖酵解過程中一種重要的代謝產物，具有調節糖酵解中限速酶磷酸果糖激酶及丙酮酸酶活性的功效，可以從分子水平恢復、改善細胞代謝[1-2]。其口服制劑和注射液臨床上多用于治療心絞痛、心肌缺血、心肌梗死、休克或大面積燒傷等[3-4]。除了臨床應用外，FDP還具有抗疲勞、耐缺氧的保健功能。關于FDP的安全性，已經有注射毒性研究的報道[5-6]。本文針對1,6-二磷酸果糖三鈉鹽（FDP）的口服應用，進行了急性毒性試驗和遺傳毒性試驗，為口服用藥和保健食品的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1,6-二磷酸果糖三鈉鹽，白色結晶粉末，純度≥96%，由國內某企業提供。

1.2 試驗動物

由山東大學實驗動物中心提供的健康SPF級昆明種小鼠。實驗環境溫度20℃～24℃，相對濕度40%～60%。

1.3 試驗方法

1.3.1 小鼠急性毒性試驗（最大耐受量MTD試驗）

健康昆明種小鼠20只，雌雄各占一半，體重為18～22g。取樣品10g，用蒸餾水溶解并定容至25mL，小鼠空腹16h后，每次間隔4h，以0.25mL/10g.bw容量灌胃2次，總劑量為20.0g/kg.bw，連續觀察14天并記錄小鼠中毒表現及死亡情況。

1.3.2 遺傳毒性試驗

1.3.2.1 Ames試驗

采用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株試驗菌進行試驗，多氯聯苯（PCB）誘導的大鼠肝勻漿為體外代謝活化系統。試驗組設 8、40、200、1000、5000μg/皿 5 個劑量，每個劑量做3個平行。稱取1.25g樣品，用蒸餾水溶解并定容至25mL，混勻，滅菌，4℃存放備用。臨用前將上述溶液依次用滅菌蒸餾水稀釋成：50000μg/mL（原液）、10000μg/mL、2000μg/mL、400μg/mL、80μg/mL。在頂層瓊脂中加入0.1mL試驗菌液、0.1mL受試樣品溶液（溶劑對照組加0.1mL滅菌蒸餾水）和0.5mL S-9混合液（需要代謝活化時），混勻后倒入底層培養基平板。設自發回變和陽性對照。37℃培養48h并計數每皿回變菌落數。受試物的回變菌落數達到自發回變菌落數的2倍以上，并具有劑量-效應關系則為陽性。試驗在相同條件下重復操作兩次。

1.3.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

篩選50只體重25g～30g小鼠，隨機分5組，每組10只，雌雄各半。受試物設2.50、5.00、10.00g/kg.bw三個劑量。以環磷酰胺（劑量為40mg/kg.bw）為陽性對照，蒸餾水為陰性對照。分別稱量受試物 2.50、5.00、10.00g，用蒸餾水溶解，定容至25mL，灌胃量為0.25mL/10g.bw。間隔24h，共灌胃2次，末次灌胃后6h，處死小鼠，取胸骨骨髓涂片并固定染色，在光學顯微鏡下，觀察200個嗜多染紅細胞PCE并計數正染紅細胞NCE，計算PCE/NCE比值，每只小鼠計數1000個嗜多染紅細胞，對微核率（以含微核的嗜多染紅細胞千分率計）進行統計學處理。

1.3.2.3 小鼠精子畸形試驗

篩選25只體重30g-35g的性成熟雄性小鼠，隨機分5組，每組5只，受試物劑量分別為2.50、5.00、10.00g/kg.bw。以環磷酰胺（40mg/kg.bw）為陽性對照，蒸餾水為陰性對照。分別稱取受試物 2.50、5.00、10.00g，用蒸餾水溶解，定容至 25mL，灌胃量為0.25mL/10g.bw。每天灌胃，連續5天，末次灌胃后30天處死小鼠，取附睪制片，染色，每組統計5只動物，每只動物計數1000個精子，要求結構完整，計算精子畸形率（以百分率計）并進行統計學處理。

2 結果與分析

2.1 急性毒性試驗

由表1可見，將1，6-二磷酸果糖三鈉鹽以20.0g/kg.bw的劑量給小鼠灌胃后，部分小鼠出現步態不穩，易跌倒，約45min后癥狀消失，繼續觀察14天，無明顯的中毒癥狀，也無死亡。將小鼠處死后進行解剖檢查，心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟、胃、腸等主要器官，均未見明顯異常改變。受試樣品對雌雄小鼠的MTD均大于20.0g/kg.bw。

2.2 遺傳毒性試驗

2.2.1 Ames 試驗

由表2、表3可見，1，6-二磷酸果糖三鈉鹽各劑量組回變菌落數均不超過自發回變菌落數的2倍，且無劑量-效應關系，對鼠傷寒沙門氏菌四株菌株，在加與不加S-9混合液時，均未呈現遺傳毒性。

2.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

由表4可見，1，6-二磷酸果糖三鈉鹽各劑量組與陰性對照組相比微核率無統計學差異（P＞0.05）；環磷酰胺組與陰性對照相比有顯著性差異（P＜0.01）。1,6-二磷酸果糖三鈉鹽對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率無影響。各組未見明顯細胞毒性。

表2 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽-Ames試驗結果1

表3 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽-Ames試驗結果2

表5 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽對小鼠精子畸形率的影響

2.2.3 小鼠精子畸形試驗

受試物各劑量組小鼠精子畸形率分別為1.84%、1.76%、1.90%，與陰性對照組1.82%相比差異不顯著性（P＞0.05），而環磷酰胺組精子畸形率5.18%與陰性對照組相比有顯著差異（P＜0.01）。1，6-二磷酸果糖三鈉鹽對小鼠精子畸形率無影響。

3 結論

表4 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽對小鼠骨髓微核率的影響

經口給予小鼠1,6-二磷酸果糖三鈉鹽進行急性毒性試驗，兩種性別動物的MTD均大于20.0g/kg.bw。按照《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003版）[7]中的急性毒性分級標準，1,6-二磷酸果糖三鈉鹽屬于無毒級。遺傳毒性試驗中，1,6-二磷酸果糖三鈉鹽Ames試驗結果為陰性，對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率和小鼠精子畸形率均無影響，無遺傳毒性。

4 討論

1，6-二磷酸果糖三鈉鹽是以葡萄糖為原料，經釀酒酵母發酵制成的。據報道，口服1，6-二磷酸果糖三鈉鹽具有抗酒精中毒、抗疲勞、耐缺氧的功效[8-11]，作為保健食品原料有很好的應用前景。馮美云等研究了1，6-二磷酸果糖營養液對人體抗疲勞能力的影響，試驗組服用1.8g/d，可加快運動后心率的恢復，增加血乳酸的消除速率，提高無氧代謝的輸出功率和總功[12]。Chen Hongnian等人研究了1,6-二磷酸果糖鈉鹽抗疲勞作用的藥效學，實驗組運動員服用1，6-二磷酸果糖鈉鹽可加快消除血乳酸、降低訓練后肌酸激酶水平，恢復磷酸果糖激酶活性，在厭氧訓練后抗疲勞作用明顯[13]。上述文獻[8-13]中試驗動物和運動員均未出現不良反應的報道。

本實驗對1，6-二磷酸果糖三鈉鹽的安全性進行了初步評價，小鼠的最大耐受量大于20.0g/kg.bw，屬于無毒級且無遺傳毒性，為進一步的安全論證和產品的開發提供了理論依據。