SOX4介導的EMT在肺癌中的作用及其機制

余 坤，李鴻生，張琳玲，杜亞茜，李 權，王曉雄，蔡靜靜，馬露瑤，周永春

肺癌作為當下“頭號殺手”，是全球病死率最高、發展最快的肺原發性惡性腫瘤。2019年初，新的癌癥統計名單公布，肺癌依舊獨占鰲頭[1-2]，其中，女性肺癌例數呈逐年遞增態勢，防控形勢嚴峻[3]。有研究[4]顯示，帶有轉移灶的晚期肺癌患者，經治療后的5年生存率不足10%，臨床腫瘤患者90%以上死于腫瘤轉移。轉移是造成肺癌難以根治的最根本原因。國內外眾多研究發現多種因子發揮轉錄與非轉錄作用參與腫瘤的生物學行為，其中，性別決定基因-相關蛋白結構域4[sex determining region Y-related(SRY)-type high mobility group (HMG)-box4,SOX4]基因位于Y染色體的6p22.3[5]可通過活化Wnt、TGF-β、Hedgehog及Notch等通路或經miRNA的調節，參與多癌種的增殖、遷移與侵襲。但到目前為止，對SOX4在肺癌發生發展中的作用機制尚未明確。因此，該研究通過細胞培養及分子實驗探討SOX4與上皮細胞-間充質細胞轉化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)間的相互關系及其機制，為精準醫療、臨床監測、預后評估及科研工作提供理論指導，同時，為各類型肺癌的個體化診療提供新的生物學標志物和潛在的干預靶點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株人正常上皮細胞(BEAS-2B)；肺腺癌細胞(95D、A549、H1299、H23、H292、HCC827、SPCA-1、XWLC-05)；肺鱗癌細胞(H226、SK-MES-1)、大細胞肺癌細胞(H460)由教育部高原區域性高發腫瘤國際合作聯合實驗室、云南省肺癌研究重點實驗室提供；正常支氣管上皮細胞16HBE、小細胞肺癌細胞H446、肺腺癌細胞H157由中國科學院昆明動物研究所陳勇斌課題組饋贈。

1.2 主要試劑質粒由上海吉瑪公司構建；DMEM、RPMI 1640、FBS、Opti-MEM、0.25% Trypsin-EDTA (1X)購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；cOmpleteTMProtease Inhibitor Cocktail、PCR反應試劑盒購自美國Roche公司；BD Matrigel Basement Membrane Matrix購自美國B.D公司；6.5 mm Transwell? with 8.0 μm Pore Polycarbonate購自美國Corning公司；RABBIT anti-SOX4 polyclonal antibody購自美國Millipore公司；Anti-SNAIL antibody(Goat)、Anti-Vimentin antibody (Mouse)、Anti-N-Cadherin antibody (Rabbit)和Anti-E-Cadherin antibody (Mouse)購自美國Abcam公司；Anti-Mouse IgG(HRP-Linked)Antibody和Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody購自美國CST公司；Rabbit Anti-Goat IgG(H+L)HRP購自美國Affinity公司。

1.3 主要儀器二氧化碳培養箱(型號：3311)、生物安全柜(型號：HYCD-282)購于美國Thermo Scientific公司；熒光定量PCR儀(型號：7500)購于美國Life Technologies公司；倒置熒光顯微鏡(型號：DMI4000B)購于德國LEICA公司；核酸蛋白定量儀(型號：NanoDrop2000)、酶標儀(型號：1510)購于美國Thermo公司。

1.4 實驗方法

1.4.1細胞培養 BEAS-2B、SK-MES-1培養于DMEM高糖培養基(含10% FBS、1% PS)，余細胞培養于1640完全培養基(含10% FBS、1% PS)，放置37 ℃、5% CO2細胞培養箱中，細胞貼壁生長至80%左右，用血球計數板與細胞計數儀MoxiZ_Firmware計數，以每孔1.2×105個細胞進行6孔板鋪板。參照Lipofectamine 2000轉染試劑盒中提供的操作說明進行轉染。設置Blank為空白對照組、GFP為質粒對照組、NC為shRNA對照組；pEX-2-SOX4為過表達實驗組，siRNA803為沉默實驗組。

1.4.2實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測目的基因表達情況 按TRIzol法提取RNA試劑盒說明書，提取各組對數生長期的細胞RNA。按照RNA反轉錄合成試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA。本研究所用PCR引物由云南擎碩科技有限公司合成，引物序列見表1。以cDNA為模板，RPS18為內參，采用兩步法行PCR檢測：第1步預變性95 ℃、5 min；第2步變性95 ℃、5 s，退火延伸60 ℃、30 s；40個循環。以2-ΔΔCt表示mRNA相對表達水平。

表1 實時定量PCR目的基因的引物

1.4.3蛋白質免疫印跡(Western blot, WB)檢測 成功轉染目的質粒48 h后，在冰上用配好的裂解液進行總蛋白提取。BCA法進行標準曲線的繪制及蛋白濃度測定，以40 μg對應體積上樣，經SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白分子濕轉到PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉120 min后加入一抗(SOX4稀釋比例為1 ∶500；β-actin稀釋比例為1 ∶1 000；E-鈣黏附素(E-Cadherin,E-Cad)稀釋比例為1 ∶500；N-鈣黏蛋白(N-cadherin, N-Cad)稀釋比例為1 ∶500；波形蛋白(vimentin, Vim)稀釋比例為1 ∶500；Snail稀釋比例為1 ∶500)。4 ℃搖床12 h，用TBST在搖床上漂洗3次，每次15 min后加入二抗(稀釋比例均為1 ∶2 000)搖床12 h，用TBST在搖床上漂洗3次，每次15 min，用ECL通過GeneSys曝光成像，用Image J對目標條帶進行灰度值分析。

1.4.4CCK8測定細胞增殖及細胞活性 轉染目的質粒24 h后，收集細胞，計數，調整細胞懸液濃度至5×103/ml，接種細胞于96孔板，200 μl/孔，每組設置3個復孔。完成后將孔板置于培養箱中培養相應時長。吸棄待測孔的培養液后，每孔加入10 μl CCK8溶液+200 μl對應完全培養液混合液，繼續在溫箱中培養4 h。用酶標儀測定在450 nm處各孔的吸光度(OD值)。每隔24 h對下一板重復以上操作，以此類推。

1.4.5細胞劃痕遷移實驗 選取鋪滿6孔板狀態較佳的目的細胞，用1 ml槍頭比著消毒過的無菌直尺畫九格宮，線條之間相距0.5 cm，PBS洗細胞2次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基。放入培養箱繼續培養。每隔24 h觀察細胞遷移情況。

1.4.6Transwell細胞遷移與侵襲試驗 將冰上融化且配制好的1 mg/ml Matrigel 100 μl加入小室上層并凝固成膠狀。選取生長態勢較佳的目的細胞，按比例稀釋至5×104個/ml，加200 μl到上室，而下室加800 μl 30% FBS的全培養基繼續培養。48 h后丟棄小室廢液， PBS沖洗及甲醇固定后，用結晶紫(0.1%)染色30 min，在清水下用棉棒頭小心拭去表面多余細胞，在40倍及100倍鏡下以交叉處為標記選8個視野拍照。最后再用33%醋酸1 ml浸泡每個孔2 h，洗脫結晶紫后，取200 μl至96孔板測OD值。遷移實驗除了鋪膠步驟缺省，余步驟一致。

1.4.7平板細胞克隆形成試驗 取生長態勢較佳的細胞重懸后以300個細胞的梯度密度分別接種6孔板培養至細胞克隆成型大于50個/克隆集落，4%多聚甲醛固定20 min左右，用結晶紫(0.1%)染色30 min。在100倍及200倍鏡下拍照。最后再用33%醋酸1 ml浸泡每個孔2 h，洗脫結晶紫后，取200 μl至96孔板測OD值。

1.5 統計學處理通過ImageJ、GraphPad Prism 8進行圖像處理、數據整理與統計分析，所有數據經正態性及方差齊性檢驗，對正態分布和方差齊完全隨機設計的兩組樣本的數據用兩樣本t檢驗，就完全配對或配伍設計的樣本用配對t檢驗，多組樣本比較用One-way ANOVA方差分析，對于具有非正態性或方差不齊的數據，使用秩和檢驗進行統計分析。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞培養及轉染對15株細胞進行培養，篩選出SOX4基因最有可能發揮作用的細胞株，即基礎表達量較高的各類型細胞株進行目的基因轉染(圖1A～C)，轉染效率均大于60%，且通過細胞形態及分子實驗證實成功過表達與沉默目的基因(圖2A～C)。

圖2 目的基因轉染后表達情況統計圖A、B、C：轉染目的質粒48 h，驗證過表達與沉默SOX4對SOX4基因轉錄與翻譯的影響統計圖；與GFP組比較：****P<0.000 1；與NC組比較：#P<0.05，###P<0.001；1：Blank組；2：GFP組；3：NC組；4：pEX-2-SOX4組；5：siRNA803組

圖3 細胞劃痕愈合實驗結果圖與統計圖A、B：16HBE及H157細胞轉染目的質粒后，劃痕實驗鏡下圖×40；C：16HBE細胞劃痕實驗結果統計圖；D：H157細胞劃痕實驗結果統計圖；與GFP組比較：*P<0.05，***P<0.001；與NC組比較：#P<0.05，###P<0.001；1：Blank組；2：GFP組；3：NC組；4：pEX-2-SOX4組；5：siRNA803組

2.2SOX4對肺癌細胞生物學功能的影響16HBE、H157細胞轉染目的質粒后，經細胞劃痕實驗觀察細胞生長狀況，H157細胞pEX-2-SOX4組的細胞愈合率最高，差異有統計學意義(P<0.05,n=3)，而16HBE細胞實驗組愈合率與對照組差異無統計學意義(圖3A～D)，且Transwell遷移與侵襲實驗48 h后，可見對照組細胞遷移與侵襲數量少于pEX-2-SOX4組，差異有統計學意義(P<0.05,n=3)(圖4A～F)；CCK8細胞實驗測得48 h后隨著時間的推移(圖5)，pEX-2-SOX4組細胞增殖速率較對照組逐漸增高，差異有統計學意義(P<0.05,n=6)；細胞克隆實驗證實pEX-2-SOX4組細胞克隆形成率較對照組高，差異有統計學意義(P<0.05,n=3)(圖6A～E)。

2.3SOX4介導的EMT相關因子的機制探究通過分子實驗在轉錄水平驗證SOX4對肺癌細胞EMT表型促進基因及誘導因子的表達影響(圖7)；利用統計軟件對轉染目的質粒的各類型細胞株EMT相關因子及多通路主要因子進行PCR數據整理與統計分析證實SOX4通過介導Wnt為代表的信號通路促進EMT(圖8A～C)。

圖4 Transwell細胞遷移及侵襲實驗結果圖與統計圖A、B：Transwell細胞遷移及寢室實驗結果圖 ×100；C：細胞遷移實驗成功遷移細胞數；D：細胞侵襲實驗中結晶紫A570吸光值；E：細胞侵襲實驗成功侵襲細胞數；F：細胞侵襲實驗中結晶紫A570吸光值；與GFP組比較：*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1；與NC組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；1：Blank組；2：GFP組；3：NC組；4：pEX-2-SOX4組；5：siRNA803組

圖5 CCK-8細胞增殖實驗結果統計圖與GFP組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與NC組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

SOX4參與胚胎發育與細胞命運的調控，可通過TGF-β、Wnt通路調節細胞分化、增殖和轉移，并通過相關因子促發EMT，是人類腫瘤中普遍存在的具有標志性意義的64個基因之一[6]。本實驗成功培養了15株肺正常上皮及肺癌細胞，以SOX4基礎表達量為依據，篩選出SOX4表達量最高、作用最為顯著的H157肺癌細胞進行細胞功能實驗。同時，篩選SOX4表達最高的五種類型細胞各一株進行后續機制探究。

通過過表達SOX4，細胞首先從形態上發生了轉變，由圓形、橢圓形逐步演化成長梭形，由聚集性生長，發展為趨向疏松性生長，鏡下多見散在的細胞，由此猜想細胞間的鏈接變得不再那么緊密。CCK8及平板克隆檢測過表達SOX4后細胞的增殖能力也顯著增強；侵襲實驗分析SOX4過表達后細胞侵襲能力也得到了一定的加強。劃痕與Transwell遷移實驗發現，過表達SOX4后，細胞的遷移能力呈現不同的增高，過表達SOX4能夠增強肺癌細胞的增殖、遷移與侵襲的能力，但正常細胞的遷移能力并不受SOX4表達的影響。本課題組在前期實驗中發現，SOX4在腫瘤細胞中的表達較正常肺組織顯著增高[7]，在體外實驗中也發現SOX4的沉默，抑制了腫瘤的生物學行為[8]。本部分實驗亦證實SOX4可通過介導上皮標志物E-Cad的缺失及間質標志物N-Cad、纖維連接蛋白(Fibronectin, FN)及Vim和EMT相關轉錄因子(Snail、Twist及β-catenin)的上調，以促進EMT的發生。在探究其具體機制中發現，SOX4在不同類型的肺癌中可通過多條信號通路發揮EMT的調控作用，進而促使腫瘤增殖、轉移與侵襲，具體如下：① 以16HBE為代表的正常肺細胞主要通過Smad7、TJP-1、TJP-2和WIF1來增強Wnt及TGF-β負反饋通路拮抗SOX4介導的EMT進程[9-10]。② 以H446為代表的小細胞肺癌細胞主要通過SOX4促進ADAM28加強ECM的降解[11]及直接或間接增加β-catenin的表達而加強并穩定Wnt/β-catenin信號級聯[12]，與TGF-β通路協同參與上皮表型缺失，間質表型上調而介導EMT的發生[13]。③ 以H157為代表的肺腺癌細胞機制最為復雜，SOX4促使多種EMT促進因子上調，其中，以Twist抑制E-Cad的作用最為顯著[14]，其次，包括Notch和TGF-β等在內的多條信號通路都加強了Wnt/β-catenin級聯，促進EMT的進展[15]。④ 以SK-MES-1為代表的肺鱗癌細胞主要通過SOX4介導ADAM28等因子促使ECM的降解，TGF-β、Wnt/β-catenin信號通路也有作用，但并不顯著，推測SOX4的增高負反饋引起WIF1、Smad7增多，進而拮抗了以上通路的作用，SOX4對肺鱗癌EMT作用并不顯著。⑤ 以H460為代表的大細胞肺癌細胞主要通過SOX4介導Twist、Snail、Wnt2、TGF-β的上調，增強Wnt及TGF-β等多條信號通路促進EMT的進展。

圖6 細胞生物學功能實驗結果圖與統計圖A：細胞克隆形成實驗結果圖 ×100/200；B：細胞克隆形成率；C：結晶紫A570吸光值；1：Blank組；2：GFP組；3：NC組；4：pEX-2-SOX4組；5：siRNA803組；與GFP組比較：*P<0.05，**P<0.01；與NC組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

圖7 EMT相關通路主要因子表達熱圖A：SOX4過表達和敲除后16HBE、H446、H157、SK-MES-1及H460細胞中EMT相關通路主要因子的表達熱圖；與GFP組比較，正向增加：nsP>0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1；與GFP組比較，反向減少：nsP>0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

綜上，SOX4可通過影響EMT相關因子的表達促進肺癌細胞的增殖、遷移與侵襲，Wnt及TGF-β為其主要信號通路。SOX4有望成為小細胞肺癌、肺腺癌及大細胞肺癌EMT的主要標志物與診療的潛在靶點。