SHP-2shRNA聯合苦參堿對宮頸癌細胞增殖的影響

魏林珍，奉容花，王海琳,

SHP-2是蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, PTPase)家族中的一員，與細胞的生長、增殖、分化及蛋白的磷酸化與去磷酸化的平衡等活動密切相關[1-2]。當機體因某些因素導致體內蛋白的磷酸化與去磷酸化不平衡時，會導致腫瘤惡性的發生。目前，已有研究[3]表明SHP-2與宮頸癌發生密切相關；Tao et al[4]研究證實HPV感染的宮頸癌患者組織中SHP-2高表達。故SHP-2作為腫瘤學靶標已引起了學者對抑制劑作為癌癥潛在治療劑的興趣。RNA干擾(RNA interference)利用小發夾RNA切割形成的shRNA，其通過慢病毒載體來誘導序列特異的目的基因穩定持久的沉默而發揮效應[5]。苦參是由豆科植物苦參的干燥根中所提取的中藥成分,近年來研究中，苦參堿抑制增殖抗腫瘤機制受到極大關注[6]。該研究探討SHP-2的慢病毒shRNA表達載體與苦參堿聯合抗宮頸癌細胞增殖的作用，為后續的研究宮頸癌SHP-2靶向基因與苦參堿聯合治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料載體pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro(上海漢恒生物，Hanbio)；T4連接酶(加拿大，Fermentas)；凝膠回收試劑盒(美國，Axygen)；大腸桿菌菌株DH5α(美國，Invitrogen)；限制性內切酶EcoRI和BamHI(Fermentas)；瓊脂糖、DNA ladder(加拿大，Fermentas)；瓊脂粉(上海生工)；包裝細胞293T細胞株(美國，The Global Bioresource Center)；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM(美國，Invitrogen)；質粒DNA大抽提取試劑盒(德國，Qiagen)；LipofiterTM(上海漢恒生物，Hanbio)；0.45 μm濾器(美國，Millpore公司)；苦參堿[(寶雞市方晟生物開發有限公司(純度98%)]。

1.2 方法

1.2.1靶向SHP-2基因的寡核苷酸設計 SHP-2基因靶向shRNA干擾序列設計與合成根據GenBank中SHP-2的基因序列(Accession Number; NM 129844.5)和shRNA序列表達載體pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro的要求設計3段RNA干擾序列和1段陰性對照序列，依次命名為SHP-2 shRNA1、SHP-2 shRNA2、SHP-2 shRNA3和NS。而后依據以上4段序列分別設計合成4對寡核苷酸序列(表1)。4 對寡核苷酸序列經退火后均可在5′端含EcoRI酶切位點，3′端含BamHⅠ酶切位點。

1.2.2慢病毒表達載體pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro的構建、擴增和鑒定 將pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro載體用EcoRI和BamHI進行雙酶切，酶切產物回收后與合成的寡核苷酸退火產物按照比例混合，然后依照 T4 DNA 連接酶試劑盒說明書，4 ℃連接過夜。連接產物加入DH5α感受態細菌中轉化，Amp篩選培養，挑取單菌落擴大培養，提取質粒DNA后進行DNA測序。測序正確后分別命名為pHBLV-SHP-2 shRNA1、pHBLV-SHP-2 shRNA2、pHBLV-SHP-2 shRNA3、陰性對照。

1.2.3慢病毒的包裝 將慢病毒重組質粒和包裝質粒按照 LipofiterTM轉染試劑說明書轉染細胞，簡述如下：制備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒，進行無內毒素高純度抽提后轉染293T細胞，轉染6 h后更換培養基，培養48 h和72 h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液過濾病毒上清液，濃縮之后得到高滴度的慢病毒濃縮液。

1.2.4重組慢病毒的滴度測定 應用稀釋計數法測定各組病毒的滴度。第1天，將對數期生長狀態好的293T細胞進行消化，稀釋計數后至500×104/ml, 加入96孔板，并保持100 μl/孔，每個孔有6個復孔。放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養。第2天，在EP管中做3倍梯度稀釋，連續6個稀釋度。用熒光顯微鏡觀察實驗結果，在含10%～30%孔的熒光細胞計算病毒滴度。滴度(TU/ml)=細胞數×百分比×MOI(1)×病毒稀釋倍數×103。

1.2.5細胞培養 人宮頸癌Hela細胞由蘭州大學基礎醫學研究院提供。復蘇凍存的Hela細胞，培養于DMEM 培養基(含10% FBS )，加入1%青霉素和1%鏈霉素。放入 25 cm2培養瓶，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。每1～2 d換液1 次，待細胞85%～90%融合成單層后以0.25%胰酶消化傳代。

1.2.6感染Hela細胞檢測重組慢病毒干擾效率 取對數生長期的Hela細胞按 1×105/ml 接種于6孔板中，次日待Hela生長至90%左右融合時，加入濃縮的慢病毒10 μl的同時加入 polybrene(終濃度為7 μg/ml)以提高病毒感染效率。24 h后更換為含puromycin 1 μg/ml的完全培養基以篩選細胞，同時以正常細胞株作為對照，puromycin處理48 h，觀察細胞的死亡情況，選取能夠殺死全部細胞的最低濃度。本實驗中能夠殺死Hela空細胞的最低puromycin濃度為1 μg/ml。待傳代后的細胞在大皿中長至60%，以摸索到的puromycin濃度處理48 h，48 h后Hela細胞的融合率不到80%～90%，換新鮮的puromycin的培養基繼續處理。篩完2次puromycin的細胞長滿后按1 ∶3的比例傳代，待傳代后的細胞長滿，用于收樣做后續檢驗。

1.2.7RT-PCR測定SHP-2 mRNA 有效干擾慢病毒載體TRIzol法提取慢病毒感染的Hela 細胞總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄cDNA，實時熒光定量PCR 檢測Hela細胞內SHP-2 mRNA表達水平，內參為GAPDH。反應條件：95 ℃預變性15 min，95 ℃、5 s，64 ℃退火30 s，40個循環。引物序列由上海生工生物公司合成；SHP-2 上游引物：5'-CCGGACAGGGACGTTCATT-3'；下游引物：5'-TGCTTCTGTCTGGACCATCC- 3'；hGADPH 上游引物：5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT-3'；下游引物：5'-CCATGGTGTCTGAGCGATGT'。

1.2.8CCK8法檢測感染后細胞生長活性 實驗分組如下:空白對照組、 苦參堿(1 mg/ml)組、SHP-2 shRNA組、 SHP-2 shRNA+苦參堿(1 mg/ml)組。取后對數生長的感染的宮頸癌細胞，用胰酶消化，以1×104/孔接種于96孔板，每個時間點設5個復孔， 生長24 h后吸凈培養孔內原培養液, 各組分別加入試劑, 繼續孵育24、48、96 h。棄去培養基, 加入100 μl新鮮培養基沖洗后，再加入10 μl CCK8試劑, 避光孵育2 h, 計算每孔細胞的OD值，連續檢測96 h，繪制細胞生長曲線。

1.2.9Western blot法檢測SHP-2蛋白的表達 分別提取各組細胞總蛋白,經95 ℃、10 min 變性處理的樣品進行 SDS-PAGE 電泳，采用半干法進行轉膜；5%(W/V)的脫脂奶粉溶液封閉，分別加入SHP-2 小鼠單克隆抗體(1 ∶2 000)，GAPDH小鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)，4 ℃過夜；次日加入 HRP 標記山羊抗小鼠Ig G，用37 ℃搖床孵育 2 h；ECL 化學底物發光法顯影，Image Lab 4.0軟件進行圖像灰度分析，計算 SHP-2 蛋白相對表達量用其與GADPH的灰度比值表示。

2 結果

2.1 慢病毒表達載體慢病毒表達載體pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro載體酶切后重組合成的pHBLV-SHP-2 shRNA的DNA測序結果將重組陽性克隆菌液送上海鉑尚生物技術有限公司測序，測序結果顯示所構建的慢病毒表達載體均含有所設計的目的片段，其序列與設計的靶向 SHP-2寡核苷酸序列與陰性對照序列完全一致，表明目的片段已正確插入pHBLV慢病毒載體，重組慢病毒載體構建成功。見圖1。

2.2 重組慢病毒的包裝三質粒慢病毒共同轉染293T細胞后，細胞出現了融合現象，用熒光顯微鏡下觀察，重組質粒細胞出現較強的綠色熒光(圖2)，并計算病毒原液滴度 ：病毒滴度(TU/ml)= 熒光細胞個數×1 000/每病毒原液量(μl)。轉染效率高，病毒包裝成功。

2.3 慢病毒載體轉染HeLa細胞及qRT- PCR干擾效率篩選病毒感染細胞后經puromycin篩選后,細胞生長狀態良好，形態學無明顯變化，且能穩定表達綠色熒光(圖3)。各組慢病毒感染Hela細胞48 h后，細胞生長狀態良好，轉染效率較高。Real-time PCR檢測結果顯示：hGAPDH和SHP2溶解曲線較好，證明RNA抽提和QPCR過程無問題。兩組shRNA干擾后，SHP2在Hela細胞中的表達量較空白載體組顯著降低(圖4)， SHP-2 shRNA2的沉默效果最佳(下調效率約達到94%)，因此選其干擾效果較好的載體行后續實驗。

2.4 慢病毒載體轉染后Hela生長率SHP-2 shRNA2穩定轉入Hela細胞，培養24、48和72 h后，CCK8法檢測96 孔板各孔的光密度值，計算細胞的增殖抑制率分別：(6.13±1.12) % 、(15.16±1.44) % 和(19.16±1.98)%；與對照組相比，在處理后的第48 h開始出現差異(P<0.05)。實驗同時顯示苦參堿對人宮頸癌細胞株 Hela的生長抑制呈時間依賴模式。

圖2 包裝有重組慢病毒SHP-2shRNA的293T細胞 ×100

圖3 重組病毒以MOI=10感染HeLa細胞后的感染效果 ×100A、B:光學顯微鏡；C、D：熒光顯微鏡；A、C：對照組; B、D：SHP-2 shRNA

進一步采用shRNA質粒使宮頸癌HeLa細胞SHP-2基因沉默，同時加入苦參堿(0.5 mg/ml)，檢查兩者聯合對宮頸癌細胞的增殖。結果表明聯合用藥后增殖抑制率均明顯低于單藥應用組(表2)。推測可能沉默SHP2基因的表達聯合苦參堿可能會協同抑制 Hela細胞的增殖。

表2 不同濃度苦參堿對Hela細胞增殖抑制率的影響

與對照組比較：*P<0.05

2.5 SHP2 shRNA2穩轉Hela 細胞內SHP2 蛋白水平表達結果顯示：SHP2 蛋白水平表達較空載質粒對照組顯著降低，表達水平分別為對照組(1.15±0.435)，SHP2沉默組(0.58±0.132)(P<0.05)。見圖5。

3 討論

當前研究[7]表明，腫瘤細胞依賴于腫瘤微環境。腫瘤微環境能促進腫瘤細胞生長，破壞免疫監視。腫瘤細胞與腫瘤微環境中的支持細胞通過多種信號通路進行交流。這些信號通路不僅涉及蛋白激酶的調節，而且涉及蛋白磷酸酶的失調。由蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶相互協調維持的酪氨酸磷酸化的穩定，對于廣泛的細胞過程至關重要。異常的酪氨酸磷酸化與許多人類疾病(包括癌癥)的發病機制相關[8]，這表明蛋白酪氨酸磷酸酶可能是癌癥治療的創新分子靶標。

SHP-2 屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員之一, 其與多種疾病包括腫瘤的發生和發展密切相關[9]。其N末端含有兩個Src同源結構域2(Src homology 2，SH2), C末端含有其催化結構域。其遍及于各種細胞的細胞質中,處于非活性狀態,而當與細胞膜上的底物結合后活化而發揮生物學作用。盡管現階段SHP-2在信號通路中的精確作用和下游靶點還不是很清楚,但它對細胞運動既可起到正反饋調節作用也可以起到負反饋調節作用。雖然SHP-2與多種腫瘤的發生有密切相關[10-12]，但是SHP-2 在宮頸癌的致病、轉移、耐藥等多個環節的具體作用機制不盡相同，有待深入研究。

病毒載體是一種以HIV為基礎發展而來的復制缺陷型逆轉錄病毒載體[13], 與質粒介導的 RNAi相比，它具有轉染效率高、轉移基因片段容量較大等優勢,最大的優點是能夠將遺傳物質整合到宿主的基因組, 并使其長時間在宿主細胞穩定表達,是攜帶干擾RNA的理想載體[14]。

近年來研究表明苦參堿對多種腫瘤細胞都具有抑制增殖和誘導凋亡的作用[15]，本課題前期研究結果顯示苦參堿作用后宮頸癌HeLa細胞后，隨著HeLa凋亡增加SHP-2表達增加，提示SHP-2與宮頸癌HeLa細胞增殖凋亡有一定的相關性。本課題組利用前期研究工作，設計了3 個SHP-2基因的干擾靶點, 分別將其連接在表達puromycin 和Amp的慢病毒載體pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro上，進一步包裝病毒從而得到SHP-2 shRNA慢病毒載體。用Real-time PCR結果篩選出慢病毒感染HeLa細胞后干擾效率較高的病毒載體，采用Western blot驗證細胞內SHP-2的表達水平顯著降低。本研究通過SHP-2沉默后苦參堿對細胞凋亡明顯增加，提示 SHP-2基因沉默與苦參堿對宮頸癌的生長凋亡有一定的影響。SHP-2基因對宮頸癌生長凋亡、轉移的具體機制及模型動物的基因治療需要在后續研究工作中進一步探討和研究。