局灶性腦缺血再灌注損傷對小鼠腦組織SUV39H1、H3K9及GFAP表達的影響

花向陽，卞爾保，張正偉，趙 兵

缺血性腦血管病是危害人類健康的主要疾病之一，大腦是最易受缺血等疾病影響的器官。大腦中動脈阻塞模型(middle cerebral artery occlusion model, MCAO模型)是模擬人類大腦出現缺血缺氧性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage, HIBD)常用的實驗動物模型[1-2]。組蛋白3賴氨酸9(histone 3 lysine 9, H3K9)的特異性甲基化轉移酶(SUV39H1)屬于人類SUV39家族，是最早發現的組蛋白甲基化轉移酶，主要在異染色質中發揮作用，H3K9的甲基化與轉錄的抑制有關。但H3K9及其甲基化轉移酶SUV39H1在腦缺血再灌注損傷時如何變化的相關研究國內尚未報道。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrin acidic protein, GFAP)是星形膠質細胞的特異性標志物，幾乎參與細胞內一切重要的生命活動。有報道[3]顯示在腦缺血再灌注損傷后星形膠質細胞活化。該實驗旨在研究小鼠腦部缺血再灌注損傷后對SUV39H1、H3K9及星形膠質細胞特異性標志物GFAP蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料選用45只18～25 g的清潔級成年雄性C57BL/6小鼠，購自安徽醫科大學實驗動物中心；水合氯醛購自中國天津市大茂化學試劑廠;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(tripheny-Ltetrazo-lium chloride，TTC)購自北京Solarbio公司；連續變倍顯微鏡(型號：XTL-2400)購自深圳新高電子有限公司；兔抗KMT1A(SUV39H1)多克隆抗體、兔抗H3K9多克隆抗體、兔抗GFAP多克隆抗體購自中國Abcam有限公司；兔抗β-actin 多克隆抗體購自中國博奧森生物技術公司；山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶標記購自北京中杉金橋生物技術有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制配試劑盒及聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)采購自中國碧云天生物技術有限公司；CFX Connect Real-Time PCR儀及CFX Maestro檢測系統購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1分組 將45只小鼠隨機平均分為3組，分別為空白對照組、假手術組、腦缺血再灌注組(實驗組)。空白對照組的小鼠不做任何處理；假手術組的小鼠僅尋找并分離出頸總動脈，不做缺血再灌注處理；實驗組小鼠的缺血時間設定為2 h，2 h后行再灌注處理，時間為24 h。每組中各取6只小鼠處死取腦進行TTC染色以及梗死體積的測定，其余9只小鼠提取腦組織蛋白及RNA進行Western blot及qRT-PCR實驗。

1.2.2MCAO模型的制作 本實驗以Koizumi法[4-5]作為基礎進一步改良建立腦缺血模型。小鼠腹腔注射4%水合氯醛(0.07 ml/10 g)，待小鼠麻醉效果出現后，固定于顯微操作臺上，術中用電烤燈使小鼠肛溫保持在36～37 ℃，小鼠頸部皮膚備皮，用碘伏消毒3次，在頸正中部做一長約1.5 cm的豎切口，在顯微鏡下鈍性分離皮下組織及肌肉等，可見頸總動脈(common carotid artery，CCA)位于氣管旁的頸動脈鞘內且有力的搏動，向上分離暴露出頸內動脈(internal carotid artery，ICA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)，在 ECA的深面穿兩根細線，ECA近心端打一個活結，遠心端結扎，用微血管夾暫時夾閉CCA和ECA，在兩線結之間剪一個小口，將準備好的線栓(0.1 mm栓線的頭部包有硅橡膠，紫外燈下風干后酒精浸泡)沿ECA上切開的小口插入，解開ECA上的活結，朝著ICA方向緩慢插入，再向內側、上方緩慢插入，栓線進線深度距CCA分叉處約10.0 mm，可感受到輕微阻力，此處即可將大腦中動脈(顱內動脈的主要動脈)阻塞，在ECA近心端打一死結從而固定栓線，完成后開始記錄腦缺血的時間，用浸潤生理鹽水的無菌紗布覆蓋于切口保持切口濕潤，在缺血的2 h之間保持傷口的濕潤及小鼠的肛溫在36～37 ℃，2 h后緩慢的拔出線栓，用生理鹽水沖洗傷口后縫合。假手術組小鼠僅做游離頸部血管，用浸潤生理鹽水的無菌紗布覆蓋2 h后縫合切口。待小鼠麻醉清醒后進行Longa生物學行為評分，評分為5分制，1～3分視為模型成功。術后各小鼠單籠飼養，缺血再灌注24 h后將各組小鼠麻醉，迅速開顱取腦。

1.2.3Longa生物學評分 此評分常被用來評測小鼠的神經功能缺損癥狀。0分：小鼠的活動完全正常，無任何神經功能缺損癥狀；1分：輕度神經功能缺損，將小鼠提尾懸空，出現右側前肢屈曲、抬高、肩部內收、肘關節伸直；2分：中度神經功能缺損，小鼠爬行時向缺血對側轉圈，側推時左右推動的阻力不等；3分：重度神經功能缺損，缺血對側肢體不能承受體重，站立時向右側傾倒；4分：嚴重神經功能缺損，無自主活動、意識障礙或呈筒樣滾動。其中0分缺損極輕，1～3分視為合格模型，4分為缺損過重，0分及4分均需剔除，將1～3分納入試驗標準。

1.2.4TTC染色 處死后的小鼠迅速(10 min內)取腦，置于0～4 ℃的PBS溶液中，-20 ℃冰箱冷凍30 min，置于腦槽中切取冠狀位腦切片，厚度為2 mm，放入現配的1%TTC溶液中，37 ℃恒溫水浴箱中避光染色30 min，每5 min輕輕晃動容器，使之充分染色，染色后取出腦片用PBS溶液洗滌3～5 min，用4%多聚甲醛室溫固定2 h后取出擺放于藍色背景下并拍照，TTC 染色可以使缺血梗死灶出現蒼白色，正常腦組織染成紅褐色，然后再利用圖像分析軟件Image J計算出梗死灶體積所占整個大腦體積的百分比。

1.2.5qRT-PCR分析 取各組小鼠左側大腦組織，稱量組織并加入TRIzol試劑后用勻漿器勻漿，完畢后低溫離心、氯仿抽取、75%酒精洗滌、DEPC水溶解；進行RNA濃度測量、RNA定量、稀釋、逆轉錄成cDNA；加入GFAP引物及SUV39H1引物后使用CFX Connect Real-Time PCR儀檢測各組中GFAP及SUV39H1蛋白對應基因的相對表達情況。

1.2.6Western blot實驗 取各組小鼠左側大腦組織，按1 ∶10(0.01 g腦組織加0.1 ml)的比例計算蛋白裂解液總體積，RIPA裂解液和PMSF按100 ∶1的配比與剪碎的腦組織混合加入EP管中，用勻漿器勻漿，勻漿完畢后離心，取上清液移入新的EP管中，煮蛋白。煮蛋白前提取的總蛋白運用BCA試劑盒進行蛋白定量。提取后進行Western blot實驗，制備SDS-PAGE凝膠(分離膠12%，濃縮膠5%)，按上樣量30 μg/20 μl的標準加樣進行電泳(80 V、30 min;120 V、60 min)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)濕轉(200 mA、30 min/60 min)，配置封閉液(含5%脫脂牛奶TBST封閉緩沖液)，室溫封閉90 min，β-actin(兔抗，1 ∶1 000)4 ℃過夜，GFAP(兔抗，1 ∶2 000)4 ℃過夜，KMT1A(兔抗，1 ∶1 000)4 ℃過夜，H3K9(兔抗，1 ∶1 000)4 ℃過夜。次日用辣根過氧化物酶標記的IgG(山羊抗兔，1 ∶10 000)室溫孵育1h，完畢后運用Syngene Bio Imaging檢測系統在暗室中曝光顯色，檢測各組小鼠腦組織SUV39H1、H3K9及GFAP的相對表達情況。

2 結果

2.1 各組小鼠的Longa評分比較實驗組在Koizumi法模型的基礎上進行改良線栓法制備小鼠MCAO模型，為比較各組小鼠神經功能的缺損情況，缺血2 h待麻醉清醒后進行了Longa評分。各組評分的結果表明：實驗組小鼠的Longa生物學評分為2.53±0.64分，差異有統計學意義(P<0.05)；空白對照組和假手術組的小鼠為0分，即無任何神經功能缺損表現。證明MCAO模型組小鼠的神經功能缺損癥狀明顯重于空白對照組及假手術組。

圖1 各組小鼠腦組織切片TTC染色結果A：空白對照組；B：假手術組；C：MCAO模型組

2.2 小鼠腦切片TTC染色

2.2.1TTC染色情況 空白對照組小鼠可見雙側大腦質地均勻、形態對稱，無蒼白梗死灶，腦組織全部紅染(圖1A)；假手術組小鼠腦組織也可見大腦幾乎全部紅染，大腦質地均勻、形態對稱，無蒼白梗死灶(圖1B)；MCAO模型組小鼠可見左側大腦半球出現深入皮質區、紋狀體及海馬等區域的蒼白色梗死灶，并且雙側大腦半球質地不均勻，形態不對稱(圖1C)。

2.2.2小鼠腦缺血梗死灶所占體積百分比分布情況 空白對照組：0%；假手術組：(0.41±0.25)%；MCAO模型組：(40.91±4.27)%。結果可見實驗組小鼠腦梗死面積百分比明顯高于假手術組，差異有統計學意義(F=16.81，P<0.05)。

2.3 qRT-PCR分析結果運用CFX Maestro檢測系統，測定各組小鼠腦組織中SUV39H1及GFAP蛋白對應基因的表達情況， qRT-PCR結果表明，假手術組和MCAO模型組中SUV39H1蛋白對應基因的相對表達分別為(1.17±0.15)、(6.51±0.83)；GFAP蛋白對應基因的相對表達分別為(1.14±0.17)、(10.44±1.43)。結果表明實驗組SUV39H1基因表達量高于空白對照組，差異有統計學意義(F=21.57，P<0.001)；GFAP基因表達量高于空白對照組，差異有統計學意義(F=21.72，P<0.001)。各組的SUV39H1、GFAP基因qRT-PCR結果見圖2。

2.4 相關性分析運用Graphpad Prism 7.0統計軟件，將各組小鼠腦組織中GFAP及SUV39H1蛋白對應基因的表達量進行相關性分析，分析結果表明，GFAP及SUV39H1蛋白對應基因的表達量成線性相關，具有統計學意義(r=0.9671，P<0.001)；由此可以推測GFAP及SUV39H1基因的表達具有一定的關系。見圖3。

圖2 各組小鼠腦組織GFAP、SUV39H1蛋白對應基因表達情況A:3組小鼠腦GFAP蛋白對應基因的表達;B:3組小鼠腦SUV39H1蛋白對應基因的表達;1: 空白對照組; 2: 假手術組; 3: 實驗組;與空白對照組比較:*P<0.000 1

圖3 小鼠腦組織GFAP、SUV39H1蛋白對應基因表達相關性

圖4 各組小鼠腦組織SUV39H1、H3K9蛋白表達情況A: Western blot 檢測3組小鼠腦β-actin、GFAP、SUV39H1、H3K9蛋白的表達; B: 3組小鼠梗死側腦組織GFAP蛋白的相對表達情況; C: 3組小鼠梗死側腦組織 SUV39H1蛋白的相對表達情況; D：3組小鼠梗死側腦組織 H3K9蛋白的相對表達情況；1: 空白對照組; 2: 假手術組; 3: 實驗組; 與空白對照組比較:*P<0.05

2.5 Western blot結果運用Syngene Bio Imaging檢測系統，測定各組小鼠腦組織蛋白中SUV39H1(KMT1A)、H3K9及GFAP的表達情況，Western blot結果表明，假手術組和MCAO模型組中GFAP蛋白的相對表達分別為(1.28±0.12)、(2.13±0.34)；SUV39H1蛋白的相對表達量分別為(1.05±0.04)、(1.53±0.19)；H3K9蛋白的相對表達量分別為(1.20±0.16)、(4.71±0.22)。結果表明，實驗組SUV39H1蛋白表達量高于空白對照組，差異有統計學意義(F=10.81，P<0.05)；實驗組H3K9蛋白表達量顯著高于空白對照組，差異有統計學意義(F=3.31，P<0.05)；實驗組GFAP蛋白表達量高于空白對照組，差異有統計學意義(F=6.88，P<0.05)。各組的SUV39H1、H3K9及GFAP蛋白條帶顯影情況與結果一致。見圖4。

3 討論

在腦血管病中，缺血性腦血管病占關鍵地位，死亡率居高不下。許多不同的機制涉及到缺血誘導的細胞凋亡，包括興奮毒性、氧化應激、炎癥等[6]，同時腦缺血也引起基因表達的變化，本研究的前提是MCAO模型的成功建立，故選擇在Koizumi法的基礎上建立MCAO模型，此方法的優點是操作對于小鼠的損傷較小，對腦組織的其他生理指標影響也不大，是目前建立MCAO模型運用最為廣泛的造模手法。

有研究[7]發現，人類的一種具有SET結構域的染色體蛋白，可以抑制基因的轉錄，并定義為SUV39H1，與異染色質形成有關，異染色質在基因調控水平上具有重要作用。神經保護作用是基于基因的轉錄激活[8-10]，同時Schweizer et al[11]研究發現，在體外建立氧葡萄糖剝奪模型模擬腦缺血再灌注模型時，SUV39H1在受敲除或藥理抑制時，增加了腦源性營養因子的轉錄活性，從而對氧葡萄糖剝奪后的細胞具有明顯的保護作用，腦源性營養因子在神經元的可塑性和存活中起著重要的作用，即抑制組蛋白甲基化水平的轉錄可以有效地促進神經元的存活。組蛋白H3K9及其甲基化轉移酶SUV39H1在基因層面具有重大的意義，影響基因轉錄活性而不涉及DNA序列的表觀遺傳修飾改變。組蛋白甲基化屬于一種翻譯后的修飾，一般認為，H3K9與基因轉錄抑制相關，它可以通過使目的基因啟動子處于緊密折疊的狀態來阻止目的基因與轉錄因子、RNA聚合酶接觸，阻止目的基因的轉錄[12]。同時Stewart et al[13]發現H3K9甲基化作為異染色質形成的標志，可以促進基因的沉默。H3K9甲基化可抑制組蛋白H3和H4乙?；瘡亩种妻D錄，且組蛋白H3K9甲基轉移酶SUV39H1可以結合到基因的啟動子區域，抑制基因的表達。GFAP作為星形膠質細胞的主要標志物，幾乎參與細胞內一切重要的生命活動。有報道[14]發現GFAP特異地存在于星形膠質細胞中并與星形膠質細胞的活性成正比。還有報道[3]稱在腦缺血再灌注損傷后，縫隙連接會使星形膠質細胞形成功能合胞體，位于缺血中心區垂死細胞的凋亡信號通過星形膠質細胞網絡傳播，缺血中心區的其他有害成分也可以通過功能合胞體傳播，同時在缺血的情況下,缺血中心區細胞內ATP迅速耗竭, 垂死的細胞通過星形膠質細胞形成的合胞體從附近活著的細胞中搶奪能量,從而導致更多的細胞因能量短缺而受損，進一步加重腦缺血造成的損傷。

綜上所述，本研究顯示，在成功建立MCAO模型的基礎上，Longa行為學評分表明MCAO模型組因缺血導致的神經系統損傷癥狀比假手術組及空白對照組嚴重；在腦缺血再灌注損傷后SUV39H1、H3K9及GFAP的表達明顯增加，提示組蛋白甲基化可能在局灶性缺血再灌注損傷中具有重要作用，據此推測SVU39H1表達量的增加會加重腦組織的進一步損傷；同時SUV39H1催化H3K9甲基化的過程變化，使H3K9在缺血再灌注中的表達量也大量增加，抑制基因的轉錄，但是抑制基因轉錄的具體過程以及其對腦組織缺血再灌注損傷的影響，有待于進一步研究；GFAP表達量的上升標志著星形膠質細胞的活躍，星形膠質細胞因腦缺血損傷刺激形成功能合胞體，促進凋亡信號的傳播、有害成分的傳遞以及能量的消耗，從而使腦組織的損傷進一步加重。此外本研究只觀察了SUV39H1、H3K9及GFAP的變化，探討了初步的分子機制，推測SUV39H1、H3K9與星形膠質細胞活化密切相關，使腦組織缺血再灌注損傷進一步加重，但是SUV39H1以及H3K9對星形膠質細胞活化的具體作用機制尚待于深入研究。