nanos1基因在日本血吸蟲不同發育時期的定位

華夢晴，邵延靖，劉 淼，沈際佳

血吸蟲病是一種危害嚴重的地方性疾病，我國流行的主要是日本血吸蟲病。迄今為止，尚無針對日本血吸蟲病的疫苗問世。吡喹酮因其療效好、副作用少、療程短等優點早已成為治療和控制此病的首選藥物[1]。然而在流行地區長期、反復、大規模的使用吡喹酮有可能會導致甚至加速耐藥蟲株的產生[2]。因此，尋找和研究生殖相關的基因和蛋白，為研制能夠預防和治療血吸蟲病的新型干預手段具有重要意義。

nanos基因是母源效應基因，其編碼產物是一種在羧基端具有兩個保守鋅指結構域的RNA結合蛋白，通常與pumilio共同發揮作用。nanos蛋白的功能最早發現于模式生物果蠅體內，它是果蠅建立前后體軸所必需的[3]。目前，在各種各樣的物種體內都已發現了nanos同源物，研究[4-5]結果證實nanos蛋白是大多數生物的生殖細胞發育過程中的關鍵物質。這些研究進展是研究日本血吸蟲nanos蛋白的重要參考，也是尋找能夠干預血吸蟲生殖發育靶標的重要思路。該研究通過多重序列比對和構建進化樹對日本血吸蟲nanos1蛋白進行系統進化分析，并通過原位雜交的方法探索nanos1在日本血吸蟲不同發育時期的表達情況，以期為日本血吸蟲生殖發育相關通路提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料日本血吸蟲感染陽性釘螺購自湖南省血吸蟲病防治研究所。新西蘭兔和6～8周昆明鼠由安徽醫科大學實驗動物中心提供。PMD18-T、Taq DNA聚合酶、連接酶、DL 2000 DNA Maker購自大連寶生物有限公司(Takara)。DM10000、DM5000均為北京康為世紀生物科技有限公司產品。鏈霉素、青霉素購自意大利BBI公司。中量提取質粒試劑盒購自美國Omega 公司。DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)(C.I. 11 175 025 910)、pSPT19、DIG Nucleic Acid Detection kit(Cat.No.11175041910)均購自瑞士羅氏公司。其余試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1多序列比對及系統進化分析 通過在線軟件BlastP在NCBI中對日本血吸蟲nanos1蛋白(CAX 69806.1)進行同源序列搜索，選取nanos同源蛋白共15條序列，利用DNAMAN 6.0和ClustalX 2.0.9軟件對日本血吸蟲nanos1氨基酸序列和其他物種nanos氨基酸序列進行多重序列比對。利用MAGA 5.05軟件，以ML(Maximum Likelihood)法構建系統進化樹，bootstrap檢驗值取1000。

1.2.2原位雜交

1.2.2.1探針的制備 根據日本血吸蟲nanos1基因(FN314073.1)擴增及測序結果，利用在線軟件BLAST選取了nanos1基因第416堿基至第657堿基、長度為242 bp的特異性序列。針對此段序列設計并合成引物，在上下游引物5′端分別加上限制性內切酶EcoR I和Hind III的酶切位點(下劃線部分)。上游引物：5′-GAATTCTTTGTCTCCTGGAAATGCCTGC-′3；下游引物：5′-AAGCTTGCCTGGGCAGTATTTGAT-′3。PCR擴增目的片段，然后與PMD18-T載體連接構建nanos1-PMD18-T質粒，連接產物轉化感受態XL1-BLUE大腸桿菌，在含有氨芐青霉素(ampicillin，AMP)抗性的LB固體培養基上培養14～16 h后隨機挑取克隆進行鑒定。經DNA測序正確的nanos1-PMD18-T質粒和pSPT19載體同時經EcoR I和HindⅢ雙酶切，并將nanos1-PMD18-T質粒的酶切產物與pSPT19骨架載體連接構建nanos1-pSPT19質粒。DNA測序正確后，Hind III或EcoR I單酶切nanos1-pSPT19質粒使其線性化，即為體外轉錄正義鏈探針或反義鏈探針所需的模板。利用DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)試劑盒進行體外轉錄，從而獲得DIG標記的正義鏈或反義鏈RNA探針。探針制備成功后分裝、存放于-80 ℃備用。

1.2.2.2日本血吸蟲的收集 按常規方法將日本血吸蟲陽性釘螺放在含去氯水的燒杯中逸尾蚴3 h，用腹部貼片法感染新西蘭兔，感染后18、36和42 d從其腸系膜靜脈獲取日本血吸蟲。為保證蟲體的完整，用細毛筆在冰上分離雌雄蟲并置于RNA Later中-80 ℃保存。

1.2.2.3日本血吸蟲整體原位雜交 將分離的雌雄蟲分別放入底部帶網(75 μm目)的EP管內，4%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)常溫條件下固定30 min。將雄蟲用0.1% SDS溶液(溶于50 mmol/L DTT、1% NP-40)在37 ℃條件下處理10 min，雌蟲不做此步處理。梯度甲醇脫水后置于6% H2O2溶液(用甲醇稀釋)中在日光燈下漂白20 h，以去除蟲體腸腔內的底色。梯度甲醇水化后置于0.1% SDS溶液(溶于PBSTx)內孵育10 min。蛋白酶K(1 μg/ml，溶于PBST)作透膜處理后用甘氨酸溶液(2 mg/ml，溶于PBSTx)終止蛋白酶K反應，冰上放置5 min。用PBSTx洗2次，4%PFA后固定10 min。將雌雄蟲移入12孔板內，加入預雜交液56 ℃預雜交2 h；然后加入含有正義或反義探針的雜交液，56 ℃雜交20 h，探針的終濃度為5 ng/ml。雜交后用檸檬酸鈉緩沖液(saline sodium citrate，SSC)梯度洗脫未結合的探針，然后室溫下馬來酸緩沖液(含0.1 mol/L 馬來酸、0.15 mol/L NaCl，pH 7.5)洗2次。封閉液(用馬來酸緩沖液稀釋)室溫下封閉2 h，anti-dig-AP抗體 4 ℃孵育過夜，抗體清洗液洗脫未結合的抗體，然后加入NBT/BCIP避光顯色。顯色結束后PBSTx徹底清洗，4% PFA固定10 min后再用PBSTx洗2次，無水乙醇洗20 min以去除浮色，50%乙醇和PBSTx各洗1次，最后將蟲體保存于80%甘油中，正置顯微鏡(Olympus DP73，日本)下觀察并采集圖像。

2 結果

2.1 生物信息學分析日本血吸蟲nanos1蛋白的氨基酸序列與其他物種nanos同源物的一致性分別為曼氏血吸蟲nanos1(XP_018652467.1)23%、 曼氏血吸蟲nanos2(CCD79086.1)46%、人nanos1(NP_955631.1)16%、人nanos2(NP_001025032.1)16%、日本三角渦蟲nanos(BAD88623.1)21%、鼠nanos1(NP_848508.2)22%、鼠nanos2(NP_918953.2)15%、日本血吸蟲SJCHGC03345蛋白(AAW27569.1)16%、埃及血吸蟲nanos(XP_012794143.1)21%、地中海渦蟲nanos(ABO52809.1)20%。見圖1。系統進化樹表明日本血吸蟲nanos1蛋白最終與曼氏血吸蟲nanos2聚為一支，親緣關系最近。見圖2。

2.2 制備探針所需片段的擴增以及重組質粒的鑒定以日本血吸蟲成蟲cDNA為模板，PCR擴增后目的條帶位于250 bp左右，序列與測序結果一致。重組質粒nanos1-PMD18-T、nanos1-pSPT19經HindIII和EcoR1雙酶切鑒定，均得到大小約為250 bp的片段，酶切圖譜與預期一致，證明上述2個重組質粒構建成功。見圖3。

2.3 體外轉錄RNA探針的鑒定單酶切nanos1-pSPT19質粒使其成為線性化模板，體外轉錄nanos1基因正義或反義探針。轉錄產物經普通的1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到大小約為250 bp的片段，表明DIG-RNA探針體外轉錄成功。見圖4。

2.4nanos1基因在日本血吸蟲的定位對感染后第18、24和42天3個發育階段的日本血吸蟲雌雄蟲分別設計了正義探針組和反義探針組進行原位雜交實驗。正義探針和反義探針雜交后，加入顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，BCIP)和氮藍四唑鹽(Nitro-Blue-Tetrazolium，NBT)，陽性位置顯藍紫采用DNAMAN 6.0和ClustalX 2.0.9軟件進行不同物種nanos蛋白氨基酸序列多重比對。nanos蛋白結構域用黑色下劃線標示，紅色框內是各物種間保守的氨基酸殘基CCHC，它們組成2個連續的高度保守的鋅指結構域，深色陰影部分表示所選物種中均保守的氨基酸殘基色。nanos1基因高表達于第24、42天雌蟲的卵巢和卵黃腺，第18天雌蟲高表達于卵巢，而各個發育階段的雄蟲均未觀察到明顯陽性信號。感染后第18天血吸蟲原位雜交結果見圖5，第24天見圖6，第42天見圖7。

圖1 日本血吸蟲nanos1氨基酸序列與其他物種的nanos同源物氨基酸序列多重比對

圖2 基于不同物種nanos蛋白序列構建的系統進化樹

采用MAGA 5.05構建進化樹。日本血吸蟲nanos1在進化樹中的位置被“★”標記

圖3 PCR產物及重組質粒雙酶切鑒定M1、M2: DM2000 DNA Maker；M3: DM5000 DNA Maker；1: nanos1 PCR產物；2: nanos1-PMD18-T雙酶切產物；3: nanos1-pSPT19雙酶切產物

3 討論

目前研究[4-5]認為nanos基因對生殖細胞的發育和維持是必不可少的。在扁形動物真渦蟲中nanosmRNA在發育、再生和成熟的睪丸和卵巢中都能檢測到，RNA干擾實驗[6]表明nanos缺失后會阻斷真渦蟲無性和有性生殖細胞的正常發育及再生。秀麗隱桿線蟲有3個nanos同源基因，Nos-1和Nos-2調控原始生殖細胞的分裂增殖和存活，如果沒有這兩個基因，生殖細胞在第2個幼蟲期結束時停止增殖，并以部分依賴于凋亡基因ced-4的方式死亡[7]。nanos-3與FBF蛋白相互作用，通過抑制fem-3 mRNA來實現雌雄同體從精子發生到卵子發生的轉換[8]。在小鼠基因組中已鑒定出3個nanos同源基因，nanos-1基因敲除小鼠可正常發育，沒有發現任何可檢測到的異常[9]。nanos-2缺失后，雖然雌性小鼠仍然保持正常的生殖能力，但是雄性小鼠的睪丸萎縮，并表現出不育癥狀[10]。缺失nanos-3的雌雄小鼠均喪失生育能力，生殖腺內檢測不到生殖細胞[11]。非洲爪蟾nanos1主要通過翻譯抑制作用維持原始生殖細胞的發育，nanos1的缺失將導致原始生殖細胞顯著減少以及生殖腺中的生殖細胞丟失[12]。這些研究進展是研究日本血吸蟲nanos蛋白的重要參考，也是尋找能夠干預血吸蟲生殖發育靶標的重要思路。

圖5 感染后第18天日本血吸蟲的原位雜交a、c、e、g：nanos1基因反義探針組；b、d、f、h：nanos1基因正義探針組；o：卵巢；t：睪丸

圖6 感染后第24天日本血吸蟲的原位雜交a、c、e、g：nanos1基因反義探針組；b、d、f、h：nanos1基因正義探針組；o：卵巢；t：睪丸；v：卵黃腺

圖7 感染后第42天日本血吸蟲的原位雜交a、c、e、g：nanos1基因反義探針組；b、d、f、h：nanos1基因正義探針組；o：卵巢；t：睪丸；v：卵黃腺

通過對日本血吸蟲基因組分析，目前已發現日本血吸蟲存在兩個nanos同源物，nanos1和SJCH-GC03345蛋白。本課題的研究對象是日本血吸蟲nanos1，從不同物種的nanos蛋白氨基酸序列進行多重序列比對的結果來看，nanos蛋白在不同物種間同源性較低，氨基端的氨基酸序列差異很大，呈現多樣性，但是在它們的羧基端都有兩個高度保守且連續的C-C-H-C特異鋅指結構域，符合nanos蛋白的特征。同時，可以觀察到日本血吸蟲nanos1蛋白與曼氏血吸蟲nanos2一致性最高，達到46%。系統進化樹上該蛋白最終也是與曼氏血吸蟲nanos2聚為一支，親緣關系最近。曼氏血吸蟲nanos2表達于孢蚴和成蟲生殖細胞內，與生殖細胞的維持和增殖相關[13]，也有研究[14]報道曼氏血吸蟲nanos2高表達于卵黃腺的卵黃細胞，其功能可能與性腺發育相關，由此推測日本血吸蟲nanos1也是生殖相關蛋白。感染后第18、24和42天3個發育階段的日本血吸蟲雌雄蟲整體原位雜交結果表明nanos1基因在雌蟲的卵巢和卵黃腺高表達，而各個發育階段的雄蟲均未見明顯陽性信號。但是以雄蟲cDNA為模板進行普通PCR及Q-PCR均能擴增出nanos1基因片段，說明日本血吸蟲雄蟲同樣表達nanos1基因。這就更進一步說明nanos1參與了日本血吸蟲的生殖發育過程。對于雄蟲原位雜交實驗，課題組雖然多次調整了透膜處理時間、抗體濃度等條件，仍然沒有觀察到特異性雜交信號，認為其可能的原因是nanos1基因在雄蟲體內的拷貝數較低或者表達豐度較低，達不到原位雜交方法檢測的敏感度[15]。

綜上所述，日本血吸蟲nanos1基因高表達于雌蟲的卵巢和卵黃腺，表明該基因參與了日本血吸蟲生殖器官的發育過程，為進一步研究日本血吸蟲nanos1蛋白的功能提供了線索，但是其在生殖發育相關通路中扮演的具體作用有待進一步研究。