分選蛋白SNX4在小鼠睪丸中的表達和定位研究

李 堃，劉 悅，黃 鵬，楊智昉，胡 茜，張 穎，李志宏，呂葉輝，梁 樂

分選連接蛋白 (sorting nexins, SNX)家族是進化保守的磷酸化蛋白結合蛋白，其在協調膜質貨物分類過程中起著重要作用[1]。可將SNX分為SNX-BAR、SNX-FERM、PX only 等亞科[2]。這些蛋白質在內吞小泡的降解途徑中起著分選和回收貨物的重要作用。

SNX4是SNX-BAR亞科的一個成員。SNX-BAR蛋白可以通過BAR結構域[3]的相互作用在膜表面寡聚，從而包裹膜小管。SNX4可與雙載蛋白2(amphiphysin 2)協同作用[4]，為轉鐵蛋白受體(transferrin receptor, TfR)[5]和鈣黏蛋白[6]脫離溶酶體并進入循環途徑的關鍵分子。SNX4是唯一在體外形成穩定的同二聚體或者與SNX7或SNX30形成異二聚體的SNX家族成員[3]。SNX4通過與微管運動動力蛋白的輔激活劑KIBRA結合，誘導內吞再循環小泡(endocytic recycling compartment，ETC)轉運到細胞的核周區域。該研究旨在探索SNX4在睪丸中的表達和定位，進而推測其功能。

1 材料與方法

1.1 材料選擇出生后8周雄性C57BL/6小鼠，體質量約25 g，根據實驗分組，每組5只，由中科院上海實驗動物中心提供。TRIzol RNA抽提試劑(美國Invitrogen公司)；反轉錄試劑盒、DNA分子量標準、Premix ex-Taq(大連寶生物公司)；抗SNX4抗體、抗Rab5抗體、正常兔IgG、FITC標記羊抗兔IgG、TRITC標記羊抗大鼠IgG(美國Abcam公司)。Laminin包被培養皿(美國BD公司)、DMEM培養液中添加5%FBS、青鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)。新鮮配制使用。DPBS、乙醚、BSA等一般化學試劑購自上海化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠睪丸SNX家族基因表達分析 抽提小鼠睪丸總RNA后，反轉錄成cDNA。按照Premix exTaq說明書，以表1所示引物在ABI7500熒光定量PCR儀上進行定量擴增。記錄CT值，用2-ΔΔCT法計算mRNA表達變化。

1.2.2小鼠各臟器SNX4基因表達分析 抽提小鼠肝臟、脾臟、腎臟、腦、睪丸總RNA后，反轉錄成cDNA。按照Premix exTaq說明書，以表1所示引物在ABI7500熒光定量PCR儀上進行定量擴增。記錄CT值，用2-ΔΔCT法計算mRNA表達變化。

1.2.3睪丸SNX4免疫組化染色 迅速取出小鼠睪丸，去除多余組織，4%多聚甲醛固定，石蠟切片，入PBS洗3次，每次15 min。用新配置的0.3% H2O2處理，室溫30 min。PBS洗3次，每次5 min。用10%山羊血清室溫封閉1 h。滴加兔抗小鼠SNX4抗體，1 ∶100稀釋，4 ℃過夜。PBS洗3次，每次5 min。陰性對照采用免疫前兔血清或正常兔血清替代一抗，在相同條件下孵育(實驗組n=5，陰性對照組n=5)。滴加羊抗兔第二抗體，1 ∶300稀釋，室溫孵育15～ 60 min。PBS洗3次，每次5 min。滴加ABC復合物，室溫15～60 min。PBS 洗3次，每次5 min。用0.01% H2O2的DAB溶液，室溫5～30 min。用蘇木精復染細胞核。鏡檢、拍照。

表1 Real-time PCR引物

1.2.4TM4細胞培養 37 ℃水浴快速解凍復蘇TM4細胞，加入DMEM高糖培養基+10% FBS+1%青鏈霉素中，37 ℃、5% CO2培養。2～3 d換液1次，待其生長恢復穩定后，每2 d按1 ∶3傳代1次。傳代1～3次后取生長良好的細胞用于實驗。

1.2.5TM4細胞SNX4與Rab5間接免疫熒光染色 取TM4細胞，PBS洗3次，每次3 min，用10%山羊血清室溫封閉1 h，加入兔抗小鼠SNX4單克隆抗體和大鼠抗小鼠Rab5單克隆抗體，1 ∶100稀釋，4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，每次3 min，再加入FITC標記羊抗兔IgG，TRITC標記羊抗大鼠IgG，1 ∶300稀釋，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次3 min，甘油PBS封片。陰性對照組采用免疫前兔血清或正常兔血清替代一抗，在相同條件下孵育。激光共聚焦顯微鏡(LSM-510 laser scanning confocal microscope, Carl Zeiss)觀察并掃描成像。

2 結果

2.1 小鼠睪丸SNX家族基因表達分析如圖1所示，在小鼠睪丸中，SNX1和SNX4兩個SNX家族成員的mRNA相對表達量高于其它的家族成員，分別可以達到SNX33mRNA相對表達量的(20.94±0.05)倍(P=0.002 9，n=5)和(10.11±0.01)倍(P<0.003 4，n=5)。SNX3、SNX13、SNX14的mRNA的相對表達量可以達到SNX33的約5倍左右(P=0.033，n=5；P=0.036，n=5；P=0.038，n=5)。

圖1 小鼠睪丸SNX家族基因表達分析

2.2 小鼠各臟器SNX4基因表達分析如圖2所示，在小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、腦和睪丸中，其中睪丸的SNX4的mRNA的相對表達量高于其他的臟器。可以達到肝臟中mRNA相對表達量的(15.49±4.92)倍(P=0.0036,n=5)。其他幾個主要臟器之間SNX4 mRNA相對表達量無明顯差異。

圖2 小鼠各臟器SNX4基因表達分析

2.3 小鼠睪丸中SNX4表達定位免疫組織化學染色顯示，在小鼠睪丸中，SNX4染色主要集中在支持細胞(sustentacular cell, 又稱Sertoli細胞)中，在各級生精細胞中和間質細胞(Leydig 細胞)中均未見明顯染色。見圖3A。

2.4 TM4細胞中SNX4和Rab5表達定位免疫熒光染色顯示，在TM4細胞中SNX4(綠色)和Rab5(紅色)定位于細胞質中，染色呈現圓球點狀。并且在細胞中部近核周區域，SNX4和Rab5呈現共定位的狀態(黃色)。見圖3B。

3 討論

內體系統的主要功能是獲取營養、控制蛋白質和脂質代謝、保護機體免受病原體侵襲，并作為細胞膜的儲藏庫，支持Sertoli細胞膜表面積的快速變化。內吞作用將膜受體和細胞外配體進行內吞。然后，他們進入內體系統進行分選和處理。其主要途徑有：① 分子經早期內體發育成晚期內體，最終到溶酶體進行降解。② 分子由囊泡和管狀運輸載體介導，運送到目的地。其中“循環”途徑(recycling)將分子從內體傳輸到質膜，而“逆行”途徑(retrograde)將分子從內體傳輸到高爾基體，從而遠離降解途徑[7]。

SNX家族成員在內體分選轉運過程中發揮重要作用。所有的SNX家族成員都含有一個PX區域(PX domain)，PX結構域對含有磷脂酰肌醇的內體膜具有特異性。有研究[8]表明SNX家族成員SNX16與乳腺癌細胞的遷移和侵襲有關。

圖3 SNX4在睪丸和TM4細胞中的定位 ×40A:SNX4在睪丸中免疫組織化學；B:SNX4和Rab5在TM4細胞中的免疫熒光染色，上排3個圖為單個TM4細胞免疫熒光染色，圖中比例尺為20 μm；下排3個圖為共定位區域的局部放大圖像，圖中比例尺為10 μm

在SNX的眾多家族成員中，睪丸中SNX1和SNX4的表達高于其他的家族成員。SNX1往往和SNX5或者SNX6形成二聚體而作為retromer的重要組成部分[9]，在磷酸甘露糖受體，分揀相關受體L(SORLA)，Wnt 信號因子(Wls)和二價金屬轉運受體(DMT1)等受體從內體到高爾基體的轉運[10-11]起重要作用。實驗結果顯示，睪丸中SNX5的表達量相對較低，推測睪丸中SNX1和SNX6形成二聚體而參與物質的“逆行”途徑。

該實驗結果表明，睪丸中SNX4的表達高于肝臟、脾臟、腎臟和腦。這提示在睪丸中表達的SNX4可能參與了睪丸中特有的物質轉運，并且睪丸中SNX4定位于Sertoli細胞的胞質中。

Sertoli細胞不僅為生精細胞提供營養和支持作用，并且為精原細胞遷移、增殖、分化、精子發生、精子變形及結構成熟等活動提供必要的微環境。研究[12-13]表明，細胞內吞作用(endocytosis)是調節Sertoli細胞連接的重要途徑。在雄激素和細胞因子(如TNF-α、TGF-β2、TGF-β3)的作用下，Sertoli細胞通過細胞內吞作用清除細胞連接處的連接蛋白，從而“打開”細胞連接結構。這些含有連接蛋白的內吞小泡可以與早期內體融合形成內體[14]。然后，根據不同信號的調控，雄激素可以促進內體再循環[15]，將連接蛋白運輸至細胞膜，形成新的細胞連接；而TGF-β、TNF-α信號則促進內體與溶酶體融合[12-13]，降解連接蛋白，從而有利于清除細胞連接結構。在生精周期中，Sertoli細胞通過調節細胞內吞及后續囊泡運輸的方向，既保證了細胞連接周期性的“開放”，又維持了正常的血睪屏障功能。

免疫熒光染色顯示，SNX4和Rab5在Sertoli細胞系中共定位于中部近核周區域。提示SNX4可能定位于早期內體，并且可能參與了早期內體的成熟和早期內體中部分分子的再循環利用。

綜上所述，在小鼠睪丸中，SNX4高表達，定位于Sertoli細胞并且與早期內體的標志物Rab5具有共定位的特性。