IL-1β促進肺鱗癌細胞增殖的機制研究

王 偉，羅 朋，王保龍

慢性炎癥和感染是促進腫瘤發展的重要因素[1]。流行病學資料[2]顯示，慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化、吸煙、空氣污染、肺炎和職業粉塵等與非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的發生發展密切相關，提示慢性炎癥在NSCLC的發病機制中發揮重要作用。白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)作為一個重要的炎癥因子，研究[3]表明其在NSCLC患者血清中高表達，且能促進肺腺癌的增殖和遷移。肺鱗癌是NSCLC較常見的病理類型，為進一步探討IL-1β對肺鱗癌細胞增殖的影響和作用機制，現在采用平板克隆形成實驗分析IL-1β對肺鱗癌細胞增殖的影響，并運用qRT-PCR、Western blot、雙熒光素酶報告實驗和CCK-8實驗探討IL-1β參與肺鱗癌細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料肺鱗癌SK-MES-1細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞中心；胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；DMEM高糖培養基購自加拿大WISENT公司；流式CBA IL-1β檢測試劑盒購自美國BD公司；重組人IL-1β購自美國R&D公司；抗體購自Proteintech公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自南京Vazyme Biotech公司；miR-223-3p mimics、Inhibitor、p27kip1的siRNA由上海吉瑪公司合成；Lipofectamine 2000 轉染試劑購自美國Invitrogen公司；microRNA 逆轉錄和熒光定量試劑盒購自大連Takara公司；miR-223-3p和U48引物由美國Gene Copoeia公司設計和合成；CDKN1B 3′UTR載體和雙熒光素酶報告實驗檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1血漿中IL-1β含量測定 按照CBA試劑盒操作步驟進行測定：溶解標準品，進行倍比稀釋，每管加入50 μl捕獲微球；陽性對照品、陰性對照品和樣品按照同樣的操作進行，室溫避光孵育3 h, 各管加入1 ml 洗液清洗，棄上清液；加入300 μl洗液上機測定；結果由配套軟件進行分析。

1.2.2細胞培養 SK-MES-1細胞系用含有10% FBS的DMEM培養基培養于培養箱中，每1～2 d更換培養液并消化傳代，培養箱條件為37 ℃、5% CO2。

1.2.3細胞克隆形成實驗 取對數生長期的SK-MES-1細胞，以1 000個/孔接種于6孔板中，每孔加入不同濃度的IL-1β，置于37 ℃、5% CO2的溫箱中培養2周，每3 d更換1次含有相應IL-1β濃度的培養基，直至出現肉眼可見的克隆時終止培養。棄培養基后用PBS清洗2次，每次3 min。4%多聚甲醛固定30 min，0.1%的結晶紫染色1 h，細流水緩慢沖洗染液，干燥后低倍鏡觀察細胞數大于50的克隆數并拍照。

1.2.4qRT-PCR檢測細胞miR-223-3p表達 細胞作相應處理后，利用TRIzol 提取各組細胞RNA，運用Takara 逆轉錄和熒光定量PCR試劑盒檢測miR-223-3p表達，以U48作為內參，以2-ΔΔCT計算miR-223-3p相對表達量。

1.2.5Western blot法檢測p27kip1蛋白的表達 細胞作相應處理后，用PBS洗細胞3次，收集細胞，加入100 μl總蛋白提取液提取蛋白，5×上樣緩沖液與總蛋白以5 ∶1混合后，95 ℃加熱5 min。取25 μg蛋白質行凝膠電泳分離。10%脫脂牛奶封閉1.5 h后，加入相應一抗(p27kip1, 1 ∶1 000; GAPDH, 1 ∶1 000; β-actin, 1 ∶1 000)孵育，4 ℃搖床過夜。用TBST洗膜3次，每次5 min，對應二抗(1 ∶6 000)孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，于化學發光熒光顯像儀上曝光。

1.2.6細胞轉染 將對數生長期的SK-MES-1細胞接種到6孔培養板中，待細胞匯合40%～60%時進行轉染。根據LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行轉染。

1.2.7CCK-8檢測細胞增殖 收集轉染24 h后的各組細胞，調整細胞為5×104個/ml的單細胞懸液，接種到96孔板中，100 μl/孔，每組做5個復孔。待細胞貼壁(37 ℃、5% CO2培養箱培養12 h)作為0 h，向每孔中加入10 μl CCK-8溶液，溫箱孵育1 h后用酶標儀在450 nm和630 nm處測量每孔的吸光度(optical density,OD)值。細胞隔天換液，依次于培養24、48、72 h時終止培養，檢測增殖狀況。繪制生長曲線，以培養時間為橫軸，以OD值為縱軸。

1.2.8雙熒光素酶報告基因實驗 按照Luciferase Assay Reagent說明書進行：事先準備好用于轉染的分到96孔板中的293T 細胞和目的質粒，待細胞密度達到50%～70%為宜；將p53-3′UTR WT/MUT目的質粒以及5 pmol的miR-223-3p-mimics/mimics-NC充分混勻后室溫放置(溶液A)，之后將10 μl DMEM與0.3 μl 的轉染試劑(轉染試劑為漢恒生物產品，濃度為0.8 mg/ml)充分混勻(溶液B)，室溫放置5 min；將溶液A與溶液B充分混勻，室溫放置20 min；轉染前為細胞換取新鮮培養基，之后將轉染混合物加入混勻。37 ℃、5% CO2培養；轉染6 h后換取新鮮培養基，轉染48 h后收集細胞檢測。

1.3 統計學處理本研究應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。血漿IL-1β含量結果以M(P25、P75)表示，兩組間比較采用秩和檢驗。其他定量結果比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-1β在肺鱗癌患者血漿中高表達利用CBA試劑盒檢測肺鱗癌患者和健康對照者血漿中IL-1β含量，結果顯示肺鱗癌患者血漿中IL-1β含量中位數為11.96(7.55, 29.20)ng/L，高于健康對照組2.52(1.64, 3.48)ng/L，差異有統計學意義(Z=-5.06,P<0.001)，見圖1。

圖1 肺鱗癌患者與健康對照者血漿中IL-1β含量比較(n=20)與健康對照組比較：*P<0.05

2.2 IL-1β促進肺鱗癌SK-MES-1細胞克隆形成利用平板克隆形成實驗評價IL-1β對肺鱗癌細胞增殖能力的影響。不同濃度的IL-1β作用肺鱗癌SK-MES-1細胞2周后，由圖2可知，IL-1β(100 ng/L)組、IL-1β(1 000 ng/L)組相比于對照組(0 ng/L)，隨著IL-1β濃度的增加，細胞克隆數目隨之增加，表明IL-1β可以促進肺鱗癌SK-MES-1細胞克隆形成。

2.3 IL-1β能夠降低肺鱗癌SK-MES-1細胞內miR-223-3p表達100 ng/L IL-1β作用肺鱗癌SK-MES-1細胞48 h后，應用qRT-PCR檢測IL-1β對肺鱗癌細胞內miR-223-3p表達的影響。結果提示，與對照組相比(0 ng/L)，IL-1β處理組肺鱗癌SK-MES-1細胞內miR-223-3p表達降低(t=26.76,P<0.001)。見圖3。

2.4 CDKN1B是miR-223-3p直接作用的靶點運用TargetScan在線軟件(http://www.targetscan.org/)預測miR-223-3p潛在的下游靶基因，發現CDKN1B的3′UTR有miR-223-3p結合位點(圖4A)。為了驗證在線數據庫預測的CDKN1B的3′UTR能否與miR-223-3p結合，將miR-223-3p mimics或mimics-NC與CDKN1B 3′UTR 野生型(WT)或突變型(MUT)載體共轉染到HEK-293T細胞株中，分別檢測4組中熒光素酶活性。如圖4B顯示：miR-223-3p mimics與含有CDKN1B 3′-UTR端野生型質粒共轉染后, 熒光素酶活性受到抑制，提示miR-223-3p能夠結合CDKN1B 3′ UTR端。Western blot實驗結果表明：miR-223-3p mimics組肺鱗癌SK-MES-1細胞中CDKN1B蛋白(p27kip1)表達量較mimics-NC組降低；miR-223-3p Inhibitor組細胞中CDKN1B蛋白(p27kip1)表達量較 Inhibitor-NC組增加(圖4C)。綜上，miR-223-3p可直接靶向作用肺鱗癌SK-MES-1細胞CDKN1B 3′-UTR抑制其表達。

圖2 不同濃度IL-1β對肺鱗癌SK-MES-1細胞克隆形成的影響A：平板克隆形成圖；B：克隆形成數柱狀圖；a:IL-1β 0 ng/L; b:IL-1β 100 ng/L; c:IL-1β 1 000 ng/L

圖3 IL-1β對肺鱗癌SK-MES-1細胞內miR-223-3p表達的影響與對照組(IL-1β 0 ng/L)比較：*P<0.05；a:0 ng/L; b: 100 ng/L

圖4 miR-223-3p直接作用CDKN1B 3′ UTR抑制其表達A：TargetScan軟件預測CDKN1B 3′UTR有miR-223-3p結合位點；B：雙熒光素酶報告實驗驗證miR-223-3p與CDKN1B 3′UTR直接結合；與miR-NC比較：*P<0.05；C：Western blot檢測過表達和敲低miR-223-3p后對p27kip1表達的影響

2.5 IL-1β促進肺鱗癌SK-MES-1細胞p27kip1表達Western blot檢測IL-1β(100 ng/L)作用肺鱗癌SK-MES-1細胞48 h后p27kip1表達情況，由圖5A可知，相比于對照組，IL-1β處理后細胞p27kip1表達隨之增加。表明IL-1β可以促進細胞p27kip1表達。進一步利用共聚焦顯微鏡觀察p27kip1分布情況，發現肺鱗癌SK-MES-1細胞p27kip1主要分布于細胞質。綜上所述，IL-1β促進肺鱗癌SK-MES-1細胞增殖可通過降低細胞內miR-223-3p表達進而促進p27kip1表達。

2.6 下調p27kip1表達抑制肺鱗癌SK-MES-1細胞增殖利用siRNA下調p27kip1表達，CCK-8檢測肺鱗癌SK-MES-1細胞增殖，結果提示下調p27kip1表達，細胞增殖能力降低(t=9.50,P=0.001)。見圖6。

圖5 IL-1β對肺鱗癌SK-MES-1細胞p27kip1表達的影響A：Western blot檢測IL-1β對肺鱗癌SK-MES-1細胞p27kip1蛋白表達的影響；B：共聚焦顯微鏡觀察肺鱗癌SK-MES-1細胞p27kip1分布情況×400

圖6 p27kip對肺鱗癌SK-MES-1細胞增殖的影響A：Western blot檢測siRNA干擾p27kip1后其蛋白表達情況；B：CCK-8檢測敲低p27kip1后細胞增殖情況；與siRNA-NC比較：*P<0.05

3 討論

肺鱗癌是 NSCLC常見的病理類型[4-5]。與肺腺癌相比，其發病機制的研究和治療進展滯后[6-7]。因此，對肺鱗癌進行深入研究具有重要意義。慢性炎癥可導致癌變，炎癥在NSCLC發生和發展中的作用被人們所認識[8]，但其潛在的分子機制尚不清楚。

越來越多的研究[9]表明miRNAs可作為聯系炎癥與腫瘤重要樞紐，參與腫瘤的發生發展。IL-1β作為一個重要的炎癥因子，研究[3]表明其能通過環氧化酶-2/缺氧誘導因子-1α(COX-2/HIF-1α)途徑抑制miR-101表達進而促進肺腺癌的增殖和遷移，但IL-1β在肺鱗癌中的作用及其機制的研究報道較少。課題組前期研究[10]發現miR-223-3p在肺鱗癌組織中表達降低，其可與突變型p53蛋白形成反饋環路促進肺鱗癌的增殖和遷移。另外，研究[11]顯示：單核細胞經IL-1β和腫瘤壞死因子-α刺激后，胞內miR-223表達下調；但肺內皮細胞經IL-1β和腫瘤壞死因子-α刺激后，胞內miR-223表達上升，結果提示在不同類型的細胞中，炎癥因子對細胞內miR-223的表達存在差異。本研究證實在肺鱗癌患者血漿中IL-1β高表達，外源性加入IL-1β能夠促進肺鱗癌SK-MES-1細胞的增殖，且使細胞內miR-223-3p表達降低，結果提示高表達的IL-1β通過降低細胞內miR-223-3p表達促進細胞增殖。

通過軟件預測、雙熒光素酶報告實驗和Western blot證實miR-223-3p可以直接靶向CDKN1B(p27kip1)的3′ UTR 抑制其表達。p27kip1是一種細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclindependent kinase, CDK)抑制因子，通過與細胞周期蛋白/細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin/cdk)復合物結合調節細胞的增殖、遷移和凋亡[12]。研究[13]顯示，分布于細胞核和細胞質中p27kip1具有不同的功能：細胞核中p27kip1主要作為CDK抑制劑調節細胞周期，而細胞質中p27kip1具有抗凋亡、促進細胞遷移作用。近期研究[14]表明，p27kip1的異常表達和亞細胞分布與惡性腫瘤的發生發展密切相關。本研究通過共聚焦顯微鏡觀察發現，p27kip1在肺鱗癌SK-MES-1細胞中主要分布于細胞質，外源性IL-1β能夠促進細胞p27kip1表達。敲低p27kip1表達后，細胞的增殖降低。

綜上所述，IL-1β通過降低肺鱗癌SK-MES-1細胞內miR-223-3p表達進而使p27kip1表達增加，抑制細胞凋亡，促進細胞增殖。