糖基化終末產物誘導內皮微顆粒釋放

陳英華，馮 波

血管內皮細胞在受到損傷時，發生細胞膜受損及部分細胞膜脫落，進而形成外泌的膜性小囊泡，即內皮微顆粒 (endothelial microparticle, EMP)[1]。目前臨床觀察性研究[1-4]顯示，患有血管相關性疾病如糖尿病、冠心病、高血壓、代謝綜合癥、高脂血癥等的患者外周循環EMP水平明顯增高，同時體外實驗提示EMP具有抑制內皮舒張功能，促進氧化應激發生，使內皮細胞損傷增加等作用[1-5]。因此EMP不僅是血管損傷的生物學標記，其本身也參與血管損傷，故探索EMP產生機制尤為重要。糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)是持續高血糖引起體內多種蛋白質和脂類非酶糖基化后生成的多種不同物質的統稱，是糖尿病患者的特點，其在糖尿病血管病變中起至關重要作用[6]。該課題擬探索AGEs對EMP分泌的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器胎牛血清白蛋白、D-葡萄糖、胎牛血清、EBM-2細胞培養液、0.8 μm微球、3 μm微球購自美國Sigma-Aldrich公司;抗RAGE抗體、N-乙酰半胱氨酸購自美國Abcam公司; CD31-FITC、同型對照抗體IgG1-FITC、RAGE抗人單克隆抗體、GAPDH抗人單克隆抗體購自美國BD公司；反轉錄試劑盒、DCFH-DA購自美國Invitrogen公司；SYBR Green RT-PCR試劑盒購自日本Takara公司。熒光分光光度計F98購自上海棱光技術有限公司；流式細胞儀FACSCalibur購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1制備 將胎牛血清白蛋白與D-葡萄糖溶于PBS(pH 7.2～7.4)溶液中，使其終濃度分別為50 g/L和500 mmol/L，以0.22 μm一次性過濾器過濾除菌，于隔水式恒溫培育箱中37 ℃孵育12周。實驗前用pH為7.2～7.4的PBS透析，除去未結合的葡萄糖，使透析液中的葡萄糖濃度小于0.03 mmol/L。同時在熒光分光光度計上以激發波長為370 nm測定熒光強度，在440 nm處獲得最大吸收峰，證實生成為AGEs。制備完畢的蛋白經低溫風干后4 ℃保存。

1.2.2人臍靜脈內皮細胞干預 無菌條件下取新

生兒臍帶，采用胰酶消化法獲取內皮細胞，用2%胎牛血清、EBM-2細胞培養液，于37 ℃ 、5% CO2培養箱內培養人臍靜脈內皮細胞。取第3～4代人臍靜脈細胞按1.0×105/孔的濃度加入預鋪膠原的6孔板，無血清培養基培養3～5 h后。根據實驗分組如下：① 對照組；② 100 μg/ml AGEs組：加100 μg/ml AGEs干預；③ 200 μg/ml AGEs組：加200 μg/ml AGEs干預；④ 400 μg/ml AGEs組：加400 μg/ml AGEs干預。以上四組分別培養12 h與24 h。⑤ 抗糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)抗體組：預先加入5 μg/ml抗RAGE抗體處理內皮細胞6 h，再予400 μg/ml AGEs干預內皮細胞24 h；⑥ 活性氧 (reactive oxygen species, ROS)清除劑組：預先加入10 μmol/L ROS清除劑：N-乙酰半胱氨酸預處理6 h，再予400 μg/ml AGEs干預內皮細胞24 h。本研究經同濟大學附屬東方醫院倫理委員會批準，并獲得受試者知情同意。

1.2.3流式細胞儀檢測內皮微顆粒 收集細胞上清液進行離心：先常溫4 300 r/min離心 5 min，再10°、200 000 r/min 離心120 min，最后取得沉淀物，用50 μl PBS重懸，加3 μl CD31-FITC 抗體或 3 μl 同型對照抗體IgG1-FITC。室溫避光下孵育20 min，然后加入1 ml PBS，即可加樣流式細胞儀檢測。采用流式細胞儀FACSCalibur測定各樣本熒光信號，檢測時采用0.8 μm微球作為內參幫助內皮微顆粒定門，加進3 μm微球用于內皮微顆粒計數。同時采用同型對照消除抗體非特異性結合，減少背景噪音。測定前清理流式細胞儀的管道，所用的流式管、移液管頭均經高壓滅菌，PBS經0.22 μm過濾器過濾，排除雜質、細菌的影響。EMP定義為CD31+顆粒[7]。

1.2.4熒光定量RT-PCR檢測 各組內皮細胞總RNA采用TRIzol法提取；應用反轉錄試劑盒(Applied Biosystems)將mRNA反轉錄為cDNA。以GAPDH作為內參照基因。引物序列如下: RAGE：Forward primer 5′-GAAACTGAACACAGGCCGGA-3′；Reverse primer 5′-CACGGACTCGGTAGTTGGAC-3′；GAPDH：Forward primer 5′-TCATCAGCAATGCCTCCTGTACCA-3′；Reverse primer 5′-TATTTGGCAGGTTTCTCCAGACGG-3′。應用SYBR Green RT-PCR試劑盒進行擴增，對各組細胞的靶基因表達進行檢測。反應條件為：95 ℃(變性30 s)，60 ℃ (退火30 s)，70 ℃(拉伸15 s)循環40次；反應結束后，計算得出Ct值，計算RAGE基因的Ct值與GAPDH Ct值的差值ΔCt，以2-ΔΔCt作為RAGE mRNA的相對含量。

1.2.5Western blot檢測 細胞裂解液提取各組內皮細胞蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度。采用SDS-PAGE凝膠進行蛋白電泳，轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1 ∶500)(RAGE抗人單克隆抗體、GAPDH抗人單克隆抗體)4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗(1 ∶5 000)1 h，加入ECL顯影劑并在顯影儀中得到蛋白條帶，計算條帶的灰度值，最后以GAPDH為內參照，計算靶蛋白的相對表達量。

1.2.6流式細胞儀檢測ROS水平 收集細胞后懸浮于稀釋好的終濃度為10 μmol/l的DCFH-DA染液中，37 ℃細胞培養箱內孵育20 min。PBS洗滌、離心細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA，流式細胞儀檢測FACSCalibur。

2 結果

2.1 AGEs誘導內皮微顆粒釋放不同濃度AGEs干預內皮細胞12、24 h，流式細胞儀檢測EMP。如圖1所示，無論是干預12 h還是干預24 h，均觀察到AGEs誘導內皮細胞釋放EMP (12 h組：F=27.5，P<0.05; 24 h組：F=42.7，P<0.05)。EMP水平與AGEs干預時間相關性不大(P>0.05)。

圖1 AGEs濃度依賴誘導EMP釋放A：對照組；B：100 μg/ml AGEs組；C：200 μg/ml AGEs組；D：400 μg/ml AGEs組；與對照組比較：*P<0. 05；與100 μg/ml AGEs組比較：#P<0.05；與200 μg/ml AGEs組比較：△P<0.05

2.2 AGEs/ RAGE參與EMP釋放根據上述的實驗結果，AGEs干預時間對EMP釋放影響較小，故只對干預24 h的實驗分組進行RAGE表達檢測。RT-PCR結果顯示，AGEs干預內皮細胞后，RAGE mRNA 與對照組相比明顯增高，見圖2。Western blot結果顯示，AGEs干預內皮細胞后，RAGE蛋白表達與對照組相比明顯增高，見圖3。預先予抗RAGE抗體預處理400 μg/ml AGEs組，觀察到RAGE mRNA表達明顯受抑制(400 μg/ml AGEs組vs抗RAGEs+400 μg/ml AGEs組：t=11.1，P<0.01)，見圖2；RAGE 蛋白表達亦下降(400 μg/ml AGEs組vs抗RAGEs+400 μg/ml AGEs組：t=4.9，P<0.01)，見圖3；同時伴隨EMP水平下降(400μg/ml AGEs組vs抗RAGEs+400 μg/ml AGEs組：t=5.3，P=0.01)，見圖4。提示RAGE參與EMP產生。

圖2 AGEs干預內皮細胞引起RAGE mRNA表達變化A：對照組；B：100 μg/ml AGEs組；C：200 μg/ml AGEs組；D：400 μg/ml AGEs組；E：抗RGAE+400 μg/ml AGEs；與對照組比較：*P<0.05；與100 μg/ml AGEs組比較：#P<0.05；與200 μg/ml AGEs組比較：△P<0.05；與400 μg/ml AGEs組比較：δP<0.05

圖3 AGEs干預內皮細胞引起RAGE 蛋白表達變化A：對照組；B：100 μg/ml AGEs組；C：200 μg/ml AGEs組；D：400 μg/ml AGEs組；E：抗RAGE+400 μg/ml AGEs組；與對照組比較： *P<0.05；與100 μg/ml AGEs組比較：#P<0.05；與200 μg/ml AGEs組比較：△P<0.05；與400 μg/ml AGEs組比較：δP<0.05

2.3 ROS參與EMP釋放AGEs干預內皮細胞，ROS的水平隨之發生變化，如表1所示，AGEs以濃度依賴方式增高ROS水平，其中在400 μg/ml AGEs組，ROS水平亦與干預時間呈正相關(t=5.6，P<0.05)，但其他組間未發現干預時間與ROS相關。預先加入抗RAGE抗體處理內皮細胞，再予400 μg/ml AGEs干預細胞24 h后，其ROS表達水平下降(400 μg/ml AGEs組vs抗RAGE+400 μg/mlAGEs組：t=3.3，P=0.03)，見表1，伴隨EMP水平下降(t=5.3，P=0.001)，見圖4。預先予ROS清除劑處理400 μg/ml AGEs 組，再予400 μg/ml AGEs干預細胞24 h后，亦觀察到ROS表達水平下降(400 μg/ml組vs抗ROS+400 μg/mlAGEs組：t=5.1，P=0.007)，見表1，同時EMP水平下降(400 μg/ml組vs抗ROS+400 μg/mlAGEs組：t=7.1，P=0.001),見圖4。提示ROS作為AGEs與RAGE下游因子，參與EMP釋放。

表1 人臍靜脈內皮細胞ROS水平(平均熒光強度,

與對照組比較：*P<0.05；與100 μg/ml AGEs組比較：△P<0.05；與200 μg/ml AGEs組比較：#P<0.05；與12 h 400 μg/ml AGEs組比較：▲P<0.05；與24 h 400 μg/ml AGEs組比較：δP<0.05

圖4 抗RAGE抗體及ROS清除劑對AGEs誘導EMP釋放影響A：對照組；B：400 μg/ml AGEs組；C：抗RAGE+400μg/ml AGEs組；D：ROS清除劑+400 μg/ml AGEs組；與對照組比較：*P<0.05；與400 μg/ml AGEs組比較：#P<0.05

3 討論

我國糖尿病發病率逐步增長，大血管病變作為糖尿病的常見并發癥，對糖尿病患者的健康帶來嚴重影響。動脈粥樣硬化是糖尿病大血管病變的基本病理改變，而內皮損傷是重要始動環節[8]。血管內皮細胞在受到損傷時，發生細胞膜受損及部分細胞膜脫落，進而形成EMP[1]。在眾多與內皮損傷相關的疾病研究中，均觀察到外周循環EMP明顯升高，如糖尿病、冠心病等[1]。同時體外實驗提示EMP能抑制內皮細胞增殖、血管形成，影響內皮舒張功能，促進氧化應激發生，使內皮細胞凋亡、損傷增加等作用[1-5]。目前證實多種炎癥因子能誘導EMP的產生，如C反應蛋白、血管緊張素Ⅱ、腫瘤壞死因子-α、白介素6等[1-11]，然而糖尿病患者EMP產生的具體機制尚不明確。

本實驗組前期研究結果顯示：糖尿病患者的EMP水平和糖化血紅蛋白呈顯著正相關，提示持續高血糖參與EMP釋放[7]。持續高血糖所誘導產生的晚期AGEs是糖尿病患者獨特的特點，其在糖尿病血管并發癥的發生發展中起著十分重要的作用。因此為驗證AGEs是否參與EMP釋放，本課題組通過體外細胞方法，采取不同濃度AGEs干預內皮細胞12 h及24 h，觀察到AGEs以濃度依賴方式促進EMP釋放，而與干預時間相關性不大。同時，課題組觀察到AGEs干預內皮細胞后EMP水平增高，伴隨著RAGE表達增高，進一步采用抗RAGE抗體預處理內皮細胞，能抑制AGEs誘導EMP水平，提示AGEs通過與RAGE結合，誘導EMP的釋放。

既往研究[12-14]提示AGEs與RAGE結合后可誘導多條通路的激活，如NADPH氧化酶、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、 核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)等途徑激活，參與糖尿病血管病變。本課題組觀察到AGEs誘導EMP釋放的同時伴隨著ROS的高表達，采用抗RAGE抗體預處理內皮細胞后，ROS水平下降伴隨EMP水平下降；采用ROS清除劑預處理，亦能改善EMP水平，故根據以上的實驗結果推斷AGEs通過與受體RAGE結合后，通過誘導下游ROS的高表達，從而參與EMP的釋放。

本研究闡明AGEs誘導EMP釋放主要是通過上調RAGE表達，激活氧化應激途徑并誘導EMP釋放。這為進一步了解AGEs在糖尿病血管病變的發生發展中的作用提供了理論支持。