CDC27基因在系統性紅斑狼瘡中的表達和臨床意義

羅 清，張 露，黃自坤，李俊明

系統性紅斑狼瘡(systemiclupus erythematosus，SLE)是一種以大量病理性自身抗體產生為特征并累及全身器官的自身免疫性疾病，其發病機制復雜，為多種基因和環境因素相互作用的結果[1]。迄今為止，已經發現多種基因異常與SLE的發生和發展密切相關[2]。細胞分化周期蛋白27(cell division cycle protein 27，CDC27)是12個不同的亞基組成的細胞周期后期促進復合體(anaphase-promoting complex, APC/C)的其中一個亞基，細胞周期后期促進復合體主要經泛素化作用水解周期蛋白和分離酶抑制蛋白以調節細胞周期和有絲分裂的進程[3]。多項研究[4]發現，cdc27異常表達與細胞的增殖、遷移、分泌等功能相關，并且與垂體柄中斷綜合征、腫瘤等疾病的發生發展密切相關[5]。目前，國內外并未見關于cdc27與SLE關系的研究報道。該文擬研究SLE外周血單個核細胞cdc27表達情況及其與臨床相關性。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集32例2018年1～7月在南昌大學第一附屬醫院風濕免疫科就診的SLE患者，入選對象均符合美國風濕病學會(ACR)1997年制訂的SLE診斷標準[6]，并排除其他嚴重疾病，其中女31例，男1例；年齡16～65(41.5±11.7)歲。對照組21例，均為來自于同時間段南昌大學第一附屬醫院健康體檢正常的健康志愿者，其中女19例，男2例；年齡22～59(35.8±8.7)歲。兩組性別和年齡差異無統計學意義。詳細收集SLE患者的臨床表現和相關的實驗室檢查，并根據這些指標計算SLE疾病活動指數(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[7]。根據SLE的病程將其分為9例早期SLE(病程小于3個月)和23例非早期SLE(病程大于3個月)。入選的32例SLE患者中8例于治療前后抽取樣本進行外周血單個核細胞cdc27檢測。本實驗經醫院倫理委員會批準，患者和健康志愿者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器Ficoll分離液購自美國Sigma公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；去除DNA的PrimeScript TM 逆轉錄試劑盒、SYBR ? Premix Ex Taq TM購自大連寶生物TaKaRa公司；cdc27及內參基因β-actin引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000 紫外分光光度計購自美國Nanodrop公司；Applied Biosystems 7500型熒光定量PCR儀器購自美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1外周血單個核細胞提取 采集SLE患者及對照者清晨空腹EDTA抗凝外周血2 ml，6 h內送檢。采用Ficoll分離液分離提取外周血單個核細胞，用TRIzol試劑處理，放-80 ℃冰箱保存。

1.3.2總RNA提取 按TRIzol試劑操作說明書提取SLE患者及對照組外周血單個核細胞的總RNA，使用Nanodrop ND-1000紫外分光光度計對獲得的總RNA進行定量和質量分析。

1.3.3RT-PCR檢測 采用RT-PCR SYBR Green法，以β-actin作為內參進行cdc27的檢測。提取外周血單個核細胞總RNA后，取1 μl總RNA，利用PrimeScript反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。采用20 μl反應體系進行檢測，PCR引物序列見表1。反應體系包括：1 μl反轉錄產物、0.5 μmol/L上游引物、0.5 μmol/L下游引物、1×SYBR熒光染料試劑。PCR反應條件為：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，72 ℃、30 s，40個擴增循環。所有樣品做3個復孔。RT-PCR使用ABI7500儀器進行。分析待測標本的擴增熔解曲線，均為單峰，無非特異性擴增。根據待測標本的Ct值，采用相對定量法對RT-PCR結果進行分析，計算2-ΔCt[8]。

表1 熒光定量 PCR 引物序列

2 結果

2.1 SLE患者及對照者外周血單個核細胞中cdc27的表達結果如圖1所示，SLE組患者外周血單個核細胞的cdc27水平低于對照組，分別為0.049(0.020，0.064)和0.140(0.080，0.200)，差異有統計學意義(Z=126.0，P<0.001)。

圖1 SLE組患者和對照組外周血單個核細胞cdc27的表達與對照組比較：**P<0.001

2.2 SLE患者外周血單個核細胞cdc27表達與臨床的關系收集SLE患者的紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、血常規各參數、免疫球蛋白G、補體3、補體4、自身抗體、蛋白尿、血尿、膿尿、發熱、關節炎、胸膜炎、皮疹等實驗室指標和臨床表現，分析這些指標與SLE患者外周血單個核細胞cdc27的關系。結果顯示，SLE患者外周血單個核細胞cdc27與CRP(rs=-0.462,P=0.009)、ESR(rs=-0.358,P=0.048)、單核細胞數量(rs=-0.386,P=0.029)呈負相關 ，而與其他指標不相關。此外，本文分析了早期SLE與非早期SLE患者外周血單個核細胞cdc27表達，雖然早期SLE患者外周血單個核細胞cdc27表達水平低于非早期，但差異無統計學意義。

2.3 SLE患者外周血單個核細胞cdc27表達與治療的關系8例SLE患者根據病情嚴重程度選擇相應的治療1周后，比較治療前后SLE患者外周血單個核細胞cdc27表達水平，結果如表2所示，治療后SLE患者外周血單個核細胞cdc27表達水平上調，差異有統計學意義(P=0.005 1)。

表2 SLE患者外周血單個核細胞cdc27表達與治療的關系

2.4 外周血單個細胞cdc27對SLE診斷價值的評估為了評估外周血單個細胞cdc27對SLE診斷價值，對SLE患者和對照者的外周血單個細胞cdc27表達水平進行ROC分析，結果如圖2所示，ROC曲線下面積AUC為0.813(95%CI:0.681～0.944;P<0.001)，Cut-off值為0.071 57，敏感性為81.25%，特異性為80.95%，陽性預測值為86.67%，陰性預測值為73.91%，約登指數為0.622。

圖2 SLE組患者與對照組外周血單個細胞cdc27的受試者工作曲線分析

3 討論

雖然近二十年來，SLE的基礎和臨床研究取得了很大的進展，生物制劑以及聯合治療策略的使用，使SLE患者的10年生存率由過去不足50%，提高到目前的90%以上，但由于病因及發病機制不完全清楚，也沒有特效藥物治療，SLE的緩解率仍然不理想。因此，探尋SLE的病因及發病機制至關重要。

CDC27是APC/C復合物中的一個核心原件，在細胞有絲分裂中發揮著至關重要的作用[3]。課題組之前的研究[9]表明cdc27與自身免疫性疾病相關。此外，文獻[10]報道CDC27是TGF-β/Smads通路的一個下游分子，磷酸化CDC27可參與TGF-β誘導的APC/C活化，從而導致相應的抑制基因轉錄和抑癌作用的發生。而TGF-β作為參與維持免疫和耐受的重要效應分子，已被證實在SLE的發生和發展中發揮著至關重要的作用[11]。故推測cdc27可能參與SLE發病。但關于cdc27在SLE中的作用卻鮮有報道。本研究對SLE組患者和對照組外周血單個核細胞cdc27表達水平進行檢測，結果發現納入分析的兩組研究對象外周血單個核細胞cdc27不相同，SLE組患者外周血單個核細胞cdc27表達水平顯著低于健康對照組，且隨著疾病炎癥的嚴重程度的增加而降低，即CRP、ESR等炎癥指標越高，SLE組患者外周血單個核細胞cdc27表達水平越低。本研究進一步分析發現，SLE組患者外周血單個核細胞cdc27表達水平與治療相關，SLE患者經治療后，其外周血單個核細胞cdc27表達水平明顯上升。這些研究結果提示SLE組患者外周血單個核細胞cdc27表達水平與疾病的嚴重程度相關。

目前SLE的診斷主要依據臨床表現和自身抗體，但其臨床表現復雜，極易誤診；常用的自身抗體雖然對SLE的診斷特異性較好，但其診斷敏感性都不理想，約10%～60%[12-13]。因此，臨床上目前仍缺乏理想的SLE診斷標志物。研究[14]表明，多種SLE相關基因可能作為該疾病評估嚴重程度的指標以及潛在的診斷標志物。本研究采用ROC曲線分析外周血單個核細胞cdc27的診斷價值發現，SLE患者外周血單個核細胞cdc27的AUC為0.813(95%CI:0.681～0.944;P<0.001)，敏感性為81.25%，特異性為80.95%，對SLE的診斷有一定的參考價值[15]。

綜上，SLE患者外周血單個核細胞cdc27表達水平降低，與疾病炎癥水平以及治療相關。此外，本研究顯示外周血單個核細胞cdc27表達水平可能作為SLE診斷的潛在指標。但CDC27在SLE中所執行的具體功能還需進一步探究。