大鼠原代肺動脈平滑肌細胞的分離鑒定及低氧對其增殖的影響

張鳳玉，姚德山，李如君，王 軍，丁昌平

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是由多病因所致，主要以肺動脈壓力增高為特點的進行性和致命性疾病，通過血管收縮、肺血管重構，最終誘發右心衰竭和死亡[1]。一旦確診，生存時間一般僅為2～8年[2]。目前PAH的判定標準是：靜息狀態下平均肺動脈壓力≥3.325 kPa，運動狀態下≥3.99 kPa[3]。PAH主要分為動脈型、左心疾病型、呼吸系統疾病及低氧相關型等疾病類型，其中低氧性或稱缺氧性PAH最為常見[4-6]。肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs) 作為肺血管壁的重要組成成分，其異常增殖是肺血管重構的主要原因[6]。近年來研究[7]開始以PASMCs作為細胞模型來探討PAH的分子機制。該研究改進組織塊貼壁法原代分離及培養大鼠原代PASMCs，通過N2誘導低氧培養，擬研究低氧對于原代分離培養PASMCs的增殖影響。為研究PAH體外細胞水平研究提供良好的模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物2只8～ 10周齡的清潔級Sprague-Dawley雌性大鼠由揚州大學醫學實驗動物中心提供，體質量(160±10)g，普通飼料喂養，自由采光，飲食，室溫控制在20 ℃左右。

1.2 實驗儀器與試劑YCP系列三氣厭氧培養箱購自長沙華曦電子公司；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；CO2孵育箱購自美國Thermo公司。水合氯醛購自生工生物公司；高糖DMEM粉末和胰酶購自美國GIBCO公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；青-鏈霉素購自上海碧云天生物公司；4%多聚甲醛購自北京索萊寶公司；anti-α-SMA抗體購自美國abcam公司，FITC標記的羊抗鼠二抗和DAPI染液購自美國CST公司，CCK-8試劑盒購自日本東仁化學公司。

1.3 實驗方法

1.3.1大鼠原代PASMCs分離培養 課題組根據實際操作改進如下：水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射大鼠，麻醉后大鼠75%乙醇浸泡5 min，無菌手術臺上開胸取出肺組織，無菌PBS漂洗3次。固定肺葉兩端，手術顯微鏡下用顯微彎鑷順著肺血管走向將肺動脈及三級以下分支分離出來，剝凈血管周圍的肺組織、神經及筋膜等，分離干凈的肺血管轉移至新100 mm平板中。顯微剪縱行剪開肺血管，內膜面向上，用顯微彎鑷輕輕刮拭內層，去除內皮細胞層。眼科剪剪成約1 mm3的小塊，再接種到含1 ml DMEM培養基(含20%血清、100 U/ml青-鏈霉素)的平皿中，輕搖培養液，使每塊組織塊間距約為0.8～1.0 cm。靜置于37 ℃、5% CO2培養箱中2 h，等組織貼牢后，緩慢添加DMEM培養液(20%血清、100 U/ml青-鏈霉素)完全覆蓋住組織塊，繼續培養。

1.3.2大鼠原代PASMCs形態及生長特點的觀察 細胞從組織塊周圍爬出后，換液間歇在倒置相差顯微鏡下仔細觀察PASMCs形態及生長特點，拍照。

1.3.3細胞免疫熒光鑒定 PASMCs消化后，以約5×105個/ml的密度接種到放有蓋玻片的6孔板中，待PASMCs貼壁且密度達到30%～50%時，取出6孔板，棄去培養基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.3%Triton-X 100室溫破膜10 min，5% BSA(0.1% Triton-X 100配制)室溫封閉30 min，200 μl一抗α-SMA(1 ∶400，3% BSA、0.1% Triton-X 100配制)滴加于蓋玻片上，4 ℃過夜孵育。第2天室溫平衡1 h， PBST清洗5 min×3次，FITC標記的二抗室溫避光孵育1 h，PBST清洗5 min×3次。DAPI避光染色10 min，PBST清洗5 min×3次。熒光顯微鏡下拍照。

1.3.4低氧培養PASMCs PASMCs消化后分為低氧組和常氧組培養。低氧組持續低流量通入純N2，通過數字監控器實時控制O2濃度為1.0%，而常氧組為正常O2濃度培養。

1.3.5CCK-8檢測PASMCs增殖 96孔板中接種PASMCs約103個/孔，分為常氧組和低氧組，每組設6個復孔。分別在常氧和低氧下培養0、2、4、6、8、24、48、72 h后，取出培養板，每孔加入100 μl含有10 μl CCK-8溶液的DMEM培養基，37 ℃繼續孵育2 h，檢測425 nm處的吸光度值(optical density, OD)。

2 結果

2.1 PASMCs形態及生長特點倒置相差顯微鏡下觀察大鼠原代PASMCs在第5 d時從組織塊周圍爬出，第7天時細胞呈放射狀排列，大小不等，形態多樣主要有梭形、多角形、纖維形等(圖1A)。細胞傳代第5天，部分融合交織成網狀，多數呈長梭形，有分支狀突起，細胞部分區域多層重疊生長，高低起伏，成“峰-谷”樣(圖1B)。反復傳代3～5代均可保持良好的形態結構和功能。

2.2 PASMCs的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)免疫熒光鑒定熒光顯微鏡檢測Dapi標記的所有細胞核呈橢圓形發藍色熒光(圖2B)。檢測FITC標記的平滑肌中α-SMA，僅平滑肌細胞呈陽性反應，發綠色熒光，在平滑肌細胞胞質中平行于細胞長軸呈細絲狀表達(圖2A)。細胞平均純度達95%。

2.3 常氧與低氧組PASMCs形態差異PASMCs分別于常氧和低氧下培養，培養2 d后如圖3所示，常氧下PASMCs正常穩定生長，細胞形態呈梭形或多角形，細胞比較圓潤(圖3A)。低氧下PASMCs數量變少，細胞變細變長，細胞間隙增寬(圖3B)。

圖1 PASMCs在倒置顯微鏡下的形態學特征 ×100A：肺動脈組織爬塊第7天PASMCs形態；B：傳代第5天PASMCs形態

圖2 PASMCs的免疫熒光結果 IF×200A：α-SMA細胞免疫熒光染色陽性；B：α-SMA與Dapi染色后合并圖

圖3 PASMCs在常氧和低氧條件下細胞形態特征 ×100A：常氧組PASMCs生長狀態；B：低氧組PASMCs生長狀態

2.4 常氧與低氧組PASMCs增殖能力差異CCK-8法檢測PASMCs生長曲線。如圖4所示：不論是否缺氧PASMCs的OD值都會隨著時間增加而逐漸增高。但常氧組整體OD值(1.354 0±0.221 8，n=8)顯著高于低氧組(0.814 3±0.086 52,n=8)，常氧組PASMCs生長較低氧組快，增殖速度也明顯強于低氧組(t=2.268,P<0.05)。

圖4 PASMCs在常氧與低氧條件下生長曲線圖與低氧組比較：*P<0.05

3 討論

體外原代分離培養細胞可以排除眾多因素干擾，也可以模擬在體實驗結果，故而大量疾病模型的體外試驗開始應用體外原代分離組織細胞。本課題組為研究PAH的致病機制，改進組織貼壁法, 成功分離并原代培養出PASMCs，利用α-SMA鑒定第3代PASMCs的純度高達90%以上。

PAH形成主要歸因于PASMCs的異常增殖等。目前所有在體實驗均證實, 低氧可促進PASMCs異常增殖，誘發PAH。但體外細胞培養結果卻不一致[1]。研究[8-9]顯示低氧會抑制新生小牛PASMCs增殖; 有研究者認為低氧不直接誘導體外培養的PASMCs增殖, 只有預先用佛波酯激活細胞的蛋白激酶C, 低氧培養的PASMCs數目才會明顯增加[9-11]；徐敦全 等[12]也認為雌激素會顯著降低低氧下PASMCs的增殖。本實驗顯示低氧培養不同時間點,PASMCs的增殖情況有較大差異, 相對于常氧培養，短期低氧并不會改變PASMCs的生長狀況，而長時間低氧培養對PASMCs的增殖并沒有促進作用。眾所周知, 應對同樣的低氧環境，肺動脈對低氧的收縮反應會因血管內徑大小的不同而有差異, 有研究者發現低氧下內徑200～600 μm的貓肺動脈收縮反應最明顯, 而內徑>800 μm的貓肺動脈平滑肌細胞肌球蛋白輕鏈對低氧的刺激不發生磷酸化, 基本無收縮反應[10-11]。于天正 等[8]發現內徑為300～400 μm的PASMCs在低氧下增殖反應最明顯, 500～800 μm的PASMCs次之, 而內徑>1 000 μm的PASMCs基本無增殖, 提示低氧對PASMCs的促增殖作用會因內徑的不同而不同。

本文分離的原代PASMCs來源于雌性大鼠肺血管，研究[12-14]顯示，雌性大鼠的肺血管對低氧表現出較輕的收縮反應，細胞水平試驗亦證實，取自雌激素水平較高的動物的原代PASMCs低氧增殖反應較低，則是因為離體的肺動脈血管與原代細胞仍表達或分泌一定水平的雌激素[12]；膜性受體介導內源性雌激素降低低氧性肺動脈血管的收縮作用。雌激素抑制低氧反應增殖的可能機制為：① 內源性雌激素在大鼠PAH發生過程中發揮拮抗性作用，通過非基因組作用途徑(GPR30受體途徑)降低肺動脈壓力和基因組途徑抑制肺血管重構和PASMCs的增殖，發揮其拮抗PAH的作用[12]；② 雌激素刺激血管生成NO，通過PI3K信號途徑激活cAMP，從而抑制平滑肌細胞的增殖遷移[13]；③ 雌激素通過調節miRNA-21來調控雌激素受體對肺血管的保護作用[14]。故而雌激素可抑制低氧誘導的肺血管增殖。