松果菊苷對帕金森病模型大鼠紋狀體GRP78及MANF表達的影響

陳乃潔，鐘佳男2，唐嵐芳2，劉 婷2，楊莎莎2，許 茜，林 瑤，肖紹堅3，林友寧3，蔡 晶

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種神經系統變性疾病，其主要的病理改變為黑質-紋狀體多巴胺能神經元的丟失及路易體的形成[1]。目前研究發現，帕金森病的發病機制與過度的內質網應激相關，葡萄糖調節蛋白78(78 kDa glucose-regulated protein，GRP78)為重要的內質網伴侶蛋白，內質網應激可誘導其表達增加[2]。中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)為一種新型神經營養因子，可有效地保護并修復中腦多巴胺神經元[3]，目前認為MANF的功能與內質網應激關系密切[4]。 已有研究發現，以肉蓯蓉為主要組成成分的中藥復方對PD有一定治療作用[5]，而松果菊苷(echinacoside，ECH)是肉蓯蓉最主要的有效成分之一[6]。故本研究旨在探討松果菊苷對魚藤酮誘導的PD大鼠模型紋狀體中GRP78及MANF表達的影響，以明確中藥復方蓯蓉精治療PD的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 魚藤酮、葵花油(美國Sigma公司)；松果菊苷粉末(中國南京景竹公司)；GRP78、MANF抗體(英國abcam公司)，β-actin抗體(武漢三鷹公司)，HRP標記山羊抗兔二抗(武漢愛博泰克公司)；Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)；電泳槽及轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；DU-650型蛋白分析儀(美國Beckma公司)；5417R 高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 實驗動物與分組 無特定病原體動物(SPF)級成年健康雄性SD大鼠32只，動物合格證號：SCXK(滬)2018-0004，體質量215～245 g，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供及飼養。飼養室溫20～25 ℃，照明時間08：00～20：00，自由攝食與飲水。大鼠經適應性飼養1周后，根據SPSS軟件隨機分為正常組、溶劑組及造模組，將造模成功的PD大鼠隨機分為模型組和治療組，每組8只。

1.3 造模與給藥 魚藤酮加入葵花油配置成濃度為1.5 mg/mL的魚藤酮葵花油乳化液，造模組大鼠予以頸背部皮下注射魚藤酮葵花油乳化液1.5 mg/(kg·d)，連續注射2周，1周后休息1 d[7]。溶劑組注射等體積葵花油。造模成功后，治療組采用濃度為2 mg/mL的松果菊苷純水溶液灌胃，治療濃度為20 mg/kg，每日1次，治療2周。其余各組予以等量生理鹽水灌胃。

1.4 行為學檢測 選一直徑約3 mm的鐵絲線，水平固定于距地面30 cm處。將大鼠懸掛于鐵絲線上，以其前爪攀附，后肢或尾巴掛于線上則重新開始，不可翻坐于線上，記錄其懸掛時間[8]。各組大鼠在松果菊苷治療前1 d及治療14 d后進行檢測，每只測量3次，每次間隔約10 min，取均值分析。

1.5 取材 實驗大鼠于藥物干預14 d后取材。大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速斷頭取腦，于冰盤上取出紋狀體，0.9%氯化鈉冰溶液沖洗除去血液，濾紙吸干，置-80 ℃冰箱保存備用。

1.6 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測GRP78和MANF表達 取適量大鼠紋狀體組織，加RIPA裂解液備制勻漿組織，離心取上清。勻漿上清用蛋白質定量(BCA)法進行蛋白定量。配膠，取出蛋白樣品，水浴鍋中煮沸5 min，將樣品加入SDS-PAGE膠加樣孔中，電泳。取出已電泳完的SDS-PAGE膠放于轉膜液中，切取所需目的膠體，進行轉膜。轉膜完成后，PVDF膜用TBS搖床緩慢漂洗5 min，再放入5%脫脂奶粉中，室溫下搖床緩慢搖動封閉2 h。封閉完成后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入GRP78、MANF抗體(1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜；一抗孵育完成用TBST洗膜后，加入HRP標記山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫1 h搖床孵育，再次用TBST洗膜。最后加入ECL顯色劑(化學發光底物和穩定劑以1∶1混合)反應1 min，放置于成像儀內進行曝光成像，用Image Lab軟件半定量分析并記錄相應條帶的灰度值。

2 結 果

2.1 4組大鼠懸掛試驗結果比較 治療前，模型組與治療組大鼠懸掛時間明顯短于正常組(P<0.05)。治療14 d后，治療組大鼠懸掛時間較模型組延長(P<0.05)。詳見表1。

表1 4組大鼠懸掛試驗結果 比較(±s) 單位：s

與同時間正常組比較，①P<0.01；與同時間模型組比較，②P<0.05。

2.2 4組大鼠紋狀體GRP78、MANF蛋白表達比較 與正常組比較，模型組GRP78蛋白表達增高，MANF蛋白表達降低(P<0.01)。與模型組比較，治療組GRP78蛋白表達有所降低，MANF蛋白表達有所升高(P<0.01)。詳見表2、圖 1。

組別只數GRP78/β-actinMANF/β-actin正常組80.684 6±0.047 10.612 1±0.012 3溶劑組80.742 8±0.098 70.600 0±0.022 2模型組81.196 4±0.156 2①0.381 5±0.016 9①治療組80.882 4±0.055 0②0.444 3±0.012 0②

與正常組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05。

圖1 4組大鼠紋狀體GRP78、MANF蛋白表達

3 討 論

PD是一種好發于中老年人的神經退行性疾病，在我國65歲以上人群的患病率為1 700/10萬人，并隨年齡增長而升高。其核心運動癥狀包括：運動遲緩、肌強直及靜止性震顫，可伴有嗅覺減退或消失、抑郁、睡眠障礙等非運動癥狀。其主要病理改變為黑質致密部多巴胺能神經元變性丟失及α-突觸核蛋白異常聚集導致路易小體形成，進而使紋狀體區多巴胺遞質降低[9]。隨著對PD發病機制研究的不斷深入，研究發現內質網應激在PD發病中可能起到至關重要的作用。內質網在蛋白質的合成、加工和轉運中發揮著重要的作用，當內質網蛋白負荷超過內質網的折疊能力時，就可導致內質網中異常蛋白質的沉積，從而引起內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS可激活未折疊蛋白反應，GRP78作為內質網分子伴侶，其表達可反映內質網應激的程度[10]。早期未折疊蛋白反應可提高細胞的適應性，使內質網重新達到穩態，但持續過度的內質網應激可誘發ERS相關細胞凋亡[11]。

MANF為一種新型神經營養因子，大部分表達于內質網上，少部分以分泌的形式出現[12]。細胞實驗研究發現，MANF可選擇性地促進大鼠胚胎期黑質多巴胺能神經元存活[13]；在大鼠中，MANF可提高刺激誘發的多巴胺釋放[14]，在PD疾病模型中可有效地保護并修復中腦多巴胺神經元[3]。目前認為MANF的功能與內質網應激關系密切，MANF基因分析提示其啟動子區域存在內質網應激反應原件(ER stress response element，ERSE)[15]。研究發現，在6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導的神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)中，外源性的MANF可抑制α-突觸核蛋白的過表達，減少細胞凋亡[16]。

現代中醫將帕金森病歸于“顫證”范圍，認為其病機為腎精虧損、腦髓不足，故治法以補腎益髓為主[17]。蓯蓉精方是本課題組通過前期臨床經驗總結和基礎研究總結出來的復方，具有補腎益髓的功效，用于治療PD有一定的效果，已申請為國家專利(專利號：2011103028541)。前期臨床研究表明在西藥美多芭治療基礎上加用蓯蓉精方治療早中期PD，效果優于單用西藥治療的效果，能有效改善病人的運動功能部分評分[18]。實驗研究表明，蓯蓉精水提物及納米微粉均可有效地減少α-突觸核蛋白的聚集，減輕1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導的PD模型細胞損傷[19]。松果菊苷為蓯蓉精君藥肉蓯蓉的主要成分之一，多項研究表明，松果菊苷可顯著抑制多巴胺神經元丟失，維持黑質紋狀體多巴胺及其代謝物水平[20]。本研究發現松果菊苷干預后，大鼠的懸掛時間延長，提示松果菊苷可一定程度地改善PD行為障礙；與模型組比較，治療組GRP78蛋白表達有所降低，MANF蛋白表達升高，表明松果菊苷可能通過調節內質網應激未折疊蛋白反應，降低GRP78表達，并誘導內質網應激相關的MANF的表達，以促進多巴胺神經細胞的存活。

綜上所述，松果菊苷可能通過調節內質網應激相關蛋白GRP78表達及增加MANF的表達以改善PD的運動障礙，為探求蓯蓉精治療PD的機制提供了新的思路，后期可對相關通路進行更深入的探索。