復方五鳳草液對大鼠慢性潰瘍的藥效學篩選研究*

★ 朱思洵 黃子慧* 何玲 程兆炎 錢佳燕 夏慶鵬 胡鈺慧（.南京中醫藥大學附屬南京市中西醫結合醫院 南京 004；.中國藥科大學 南京 0009）

復方五鳳草液［1］為外用中藥，系我院名老中醫經驗方，主要用于結核性潰瘍的治療，療效確切，前期研究表明其能有效促進結核性潰瘍創面表皮生長因子VEGF、FGF-2 的表達［2］。同時臨床發現，復方五鳳草液對其他慢性創面也有一定的療效。本次實驗通過構建幾種常見的慢性創面大鼠模型，對復方五鳳草液的干預作用進行藥效學初篩，為進一步的藥效與機制研究打下基礎，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD 大鼠，180～200g，雌雄各半，由南京市江寧區青龍山動物養殖場提供，合格證號：SCXK（蘇）2017-0001。飼養條件：清潔級，（22±1）℃室溫下通風單籠飼養，晝夜自然照明，自由飲水攝食。

1.1.2 試藥 復方五鳳草液（南京市中西醫結合醫院制劑室提供，屬院內制劑）；復方黃柏液（山東漢方制藥）；康復新（湖南科倫制藥）；凍瘡膏（湖北科田制藥）。

復方五鳳草液處方：五鳳草2kg，白芨240g，貓爪草400g 等。制備工藝：將以上諸藥，加水浸過藥面，煎煮3 次，每次1h，合并煎液，濾過，濾液濃縮分裝，生藥含量為2.64g/mL。以上藥液由南京市中西醫結合醫院中藥制劑室提供，4℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組

1.2.1.1 下肢靜脈性潰瘍動物模型［3］大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉后，剪去左側大腿根部毛發，仰臥位固定。常規無菌消毒，鋪好無菌孔巾。在左側腹股溝內側做長約2cm 切口，分離皮下組織和淺筋膜等，分離并暴露髂-股靜脈約1.0cm。在其近、遠心端用動脈夾夾閉此靜脈，然后用自制無齒的12 號蚊式鉗夾閉血管，于動脈夾位置相鄰，力量為血管鉗緊1 扣，時間持續2～3s。松開蚊式鉗并進行縫合，局部皮膚常規消毒。手術后24 h，將放置血管夾取出。下肢深靜脈血栓模型制備成功3d 后，在無菌操作臺上，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，剪去左側大腿外側毛發，保證皮膚完整無破損，然后取適量脫毛膏脫毛，直徑約為3cm。大鼠俯臥位固定，局部皮膚常規無菌消毒，鋪好無菌孔巾，用直徑1.5cm 打孔器標記造模位置，剪取標記位置全層皮膚，造成直徑1.5cm 圓形皮膚缺損，深度達皮下深筋膜。

造模成功后，24 只大鼠按隨機數字表法隨機分為模型組、復方五鳳草液組、陽性藥組（復方黃柏液），共3 組，每組8 只。

1.2.1.2 燒傷性潰瘍動物模型［4］大鼠用10% 水合氯醛腹腔注射進行全身麻醉后，背部用電動剃刀剃毛暴露，將銅圓柱體模具（直徑為1.8cm）置于100.0℃電熱恒溫水浴鍋中10min，取出后立即置于大鼠背部8s，造成直徑1.8cm 的深Ⅱ度燒傷創面。

選取造模成功的大鼠24 只，分為模型組、復方五鳳草液組、陽性藥組（康復新液），共3 組，每組8 只。

1.2.1.3 壓力性潰瘍動物模型［5］將SD 大鼠腹腔內注射10%水合氯醛麻醉， 然后在其背部剃出4cm×3cm 長方形皮膚區，使背部形成一個皮島區域。然后用清水清洗，再用0.5 %碘伏溶液消毒。麻醉狀態下于左肩下0.5cm 作一3.0cm 長的貫穿皮膚全層橫切口，鈍性分離后將經過高壓蒸汽處理的環形鐵片置于切口皮膚的尾端，鐵片通過周圍筋膜固定。然后縫合切口。將大鼠放回籠內。術后24 h 將1 塊體外永久磁鐵作用于大鼠背部植入區2h引起缺血，然后移開磁鐵引起該區皮膚的血流再灌注0.5h，如此反復，每天5 個缺血-再灌注循環，連續3d。缺血-再灌注15 次，缺血時間總計30h。缺血-再灌注循環期間，大鼠給予標準飼料喂養及喂水，單獨飼養以盡可能減小交叉反應或磁鐵移位，在控制環境中允許自由活動。造模3d 后觀察大鼠創面，以大鼠施壓皮膚糜爛，針刺不出血作為判斷Ⅲ期及以上壓瘡成模標準。

選取造模成功的大鼠24 只，分為模型組、復方五鳳草液組、陽性藥組（康復新液），共3 組，每組8 只。

1.2.1.4 糖尿病潰瘍動物模型［6］大鼠適應性飼養1 周后，給予高脂高糖飼料，飼養4 周后，大鼠均禁食12h 后給予30mg/kg、1%STZ 溶液（臨用前用0.1mol/L、pH4.5 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制）單次腹腔注射。注射后第3d 采用斷尾取血法測血糖，隨機血糖≥16.67mmol/L 為糖尿病造模成功；造模不成功者再次空腹12h后注射10mg/kg、1% STZ 溶液。4 周后，大鼠以水合氯醛腹腔注射進行麻醉，背部脫毛，常規消毒，在背部制作直徑約為2.5cm 的圓形創面，深至皮下。

選取造模成功的大鼠24 只，分為模型組、復方五鳳草液組、陽性藥組（康復新液），共3 組，每組8 只。

1.2.2 給藥方法 模型建立成功后，大鼠單籠飼養，保證大鼠日常自由飲水、攝食。自然暴露1d，第2d 即為實驗開始日，記作實驗第1d，開始進行藥物干預，實驗周期為14d，每日換藥2 次。模型組：只用生理鹽水清洗創面。治療組：復方五鳳草液2mL 外用換藥，剪取適當棉片，以該液體2mL 浸濕（注意以輕擠不滴水為宜）外敷，無菌紗布包裹固定。陽性藥組：根據不同動物模型，分別以復方黃柏液2mL、康復新液2mL 外用換藥，剪取適當棉片，以該液體2mL 浸濕外敷，無菌紗布包裹固定。

1.2.3 檢測方法 治療第3d、第7d、第10d、第14d 每天早上對大鼠潰瘍創面進行相機拍照，采用Adobe Photoshop CS5 軟件圖像處理創面，得創面面積。創面愈合率按如下公式計算：

創面愈合率=（原始創面面積-未愈合創面面積）/原始創面面積×100%

1.2.4 實驗誤差 實驗過程中因大鼠的體質條件、健康狀態和飼養環境等不可抗的客觀因素存在，在實驗結果中會出現偏離正常值較大的數據，為了使分析結果更符合客觀實際，一般選擇偏離較大的最大值或最小值將其剔除。

1.2.5 統計學方法 統計學方法采用SPASS19.0軟件進行數據處理和分析，各組數據以（）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 下肢靜脈性潰瘍動物模型 本研究中，與模型組相比，復方五鳳草液給藥第3、7d 顯著促進了大鼠創面的愈合（t值=3.049，P=0.016＜0.05；t值=3.273，P=0.011＜0.05）。與陽性藥相比，效果優于復方黃柏液，但無顯著差異。給藥第10、14d 時，各組大鼠的創面已基本趨于痊愈，組間沒有顯著性差異。見表1。

表1 復方五鳳草液對大鼠下肢靜脈性潰瘍創面愈合率的影響（，n=8） %

表1 復方五鳳草液對大鼠下肢靜脈性潰瘍創面愈合率的影響（，n=8） %

注：與模型組相比，*P＜0.05。

組別 第3d 第7d 第10d 第14d模型組 45.10±2.90 87.02±2.24 93.56±3.31 98.36±1.06復方五鳳草液 61.98±4.71* 94.76±0.75* 98.92±0.68 100.00±0.00復方黃柏液 56.76±4.46 91.54±1.14 98.14±0.79 100.00±0.00

2.2 燒傷性潰瘍動物模型 本研究中，給藥前期（第3、7d）各組間無顯著性差異。但是給藥第10、14d 時，與模型組相比，復方五鳳草液能顯著促進大鼠創面的愈合（t值=2.319，P=0.49＜0.05；t值=3.429，P=0.09＜0.01）。與陽性藥相比，效果略優于康復新，但無顯著性差異。見表2。

表2 復方五鳳草液對大鼠燒傷性潰瘍創面愈合率的影響（，n=8） %

表2 復方五鳳草液對大鼠燒傷性潰瘍創面愈合率的影響（，n=8） %

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 第3d 第7d 第10d 第14d模型組 19.73±5.16 37.97±4.11 46.84±4.92 72.09±4.66復方五鳳草液 22.06±1.59 37.63±3.92 58.67±1.36* 89.64±2.10**康復新 22.18±3.90 43.79±4.35 58.87±3.34 83.96±3.93

2.3 壓力性潰瘍動物模型 實驗結果表明，復方五鳳草液對大鼠壓力性潰瘍創面愈合的影響與模型組相比并無顯著性差異。而陽性藥康復新在給藥第10、14d 顯著促進大鼠創面的愈合（t值=4.197，P=0.002＜0.01；t值=2.635，P=0.025＜0.05）。見表3。

表3 復方五鳳草液對大鼠壓力性潰瘍創面愈合率的影響（，n=8） %

表3 復方五鳳草液對大鼠壓力性潰瘍創面愈合率的影響（，n=8） %

注：與模型組相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

組別 第3d 第7d 第10d 第14d模型組 26.10±2.68 56.53±1.69 79.30±0.94 89.80±1.31復方五鳳草液 22.55±2.03 58.28±3.52 80.88±1.51 89.08±0.78康復新 27.20±2.10 63.18±3.88 86.30±1.38** 94.23±1.05*

2.4 糖尿病潰瘍動物模型 本研究中，復方五鳳草液對大鼠創面愈合的影響與模型組相比并無顯著性差異，而陽性藥復方黃柏液能促進大鼠創面的愈合，并在給藥第14d 出現顯著性差異（t值=2.322，P=0.49＜0.05）。見表4。

表4 復方五鳳草液對大鼠糖尿病潰瘍創面愈合率的影響（，n=8） %

表4 復方五鳳草液對大鼠糖尿病潰瘍創面愈合率的影響（，n=8） %

注：與模型組相比，*P＜0.05。

組別 第3d 第7d 第10d 第14d模型組 34.38±4.18 49.86±4.78 60.68±5.60 84.24±1.37復方五鳳草液 29.58±2.75 48.20±4.33 69.20±4.70 80.96±2.99復方黃柏液 40.90±2.24 62.36±3.82 73.10±3.70 88.54±1.24*

3 討論

復方五鳳草液為我院院內協定方，由五鳳草、白芨、貓爪草等組方而成，方中五鳳草行水殺蟲、祛腐解毒［7］，白芨斂瘡消腫、止血生肌［8］，貓爪草拔膿解毒，活血消腫［9］。諸藥合用，共湊提膿祛腐，活血生肌之效，促進創面愈合。臨床主要用于結核性潰瘍等慢性創面的外用治療，療效確切，且安全可靠。在此基礎上，我們通過結核性潰瘍家兔模型從巨噬細胞活化角度［10］對復方五鳳草液的作用機制做了初步探索，對M1、M2 型巨噬細胞［11］的表型指標iNOS、Arg-1 進行觀察，前期研究結果表明復方五鳳草液可能通過有效降低iNOS 的表達，促進Arg-1 的表達［12］，來平衡慢性難愈性創面中M1型募集、M2 型損耗的混合極化狀態［13］促進創面愈合。這一點為我們開展復方五鳳草液對多種慢性創面的藥效學研究提供物質基礎。

為了觀察復方五鳳草液對不同慢性創面的療效，本次實驗通過構建幾種常見慢性難愈性潰瘍的動物模型，設組比較觀察該復方外用中藥的療效，對其藥效進行初篩。

藥效初篩實驗表明：在下肢靜脈性潰瘍實驗中，復方五鳳草液給藥前期能顯著促進大鼠創面的愈合，而且效果優于復方黃柏液，但無顯著性差異。給藥后期，由于造模創口較小，各組大鼠的創面已基本趨于痊愈，組間沒有顯著性差異。整體來說，復方五鳳草液能有效治療大鼠下肢靜脈性潰瘍，促進其創面愈合。在燒傷實驗中，復方五鳳草液在給藥后期能顯著促進大鼠創面的愈合，效果略優于康復新，但無顯著性差異。總的來說，復方五鳳草液能促進燒傷創面的愈合，具有治療效果。而在壓力性潰瘍及糖尿病潰瘍實驗中，復方五鳳草液的表現不如陽性藥物組，并不能更有效地促進潰瘍愈合。這一點和我們的臨床觀察有出入，我們考慮下一步放大樣本量，調整藥物濃度后再做實驗觀察。總之本次實驗結果表明：復方五鳳草液能有效促進大鼠下肢靜脈性潰瘍、燒傷創面的愈合，可開展這兩種潰瘍模型的藥效機制研究。

眾所周知，慢性難愈性潰瘍的起病原因多種多樣，既能由某種特定細菌引發（結核性潰瘍），也可由原有基礎疾病并發而來（糖尿病潰瘍，靜脈性潰瘍），使得臨床上西醫的治療手段相對局限。加上其易纏滿反復的特點，且創傷機理研究尚不完善，慢性難愈性潰瘍已經成為臨床上困擾患者和醫療工作者的巨大難題。而祖國傳統的中醫藥外治在創面修復中扮演了極為重要的角色。復方五鳳草液是我院治療結核性潰瘍的院內制劑，前期已有大量數據表明其在治療結核性潰瘍方面的臨床效果顯著，并且其機理研究也有了很大的發現。通過這個實驗，我們認為復方五鳳草液的治療并不局限于結核性潰瘍，對其他如下肢靜脈潰瘍、燒傷性潰瘍等創面也有十分明顯的治療效果，這一結論為其進一步的藥效機制研究提供了依據，也為其以后拓寬臨床應用范圍打下了基礎。