一株綠藻Chlamydomonassp.PD-4產油性能的初步評價

摘要 [目的]評價綠藻Chlamydomonas sp.PD-4能否作為油藻的備選藻株。[方法]研究該藻基本的生化組成以及不同培養條件下該藻的生長、油脂含量以及脂肪酸組成，并且觀察該藻的氣浮現象。[結果]該藻在100 μmol/（m2·s）培養9 d可產25.81%蛋白、18.82%油脂以及23.50%糖。該藻在200 μmol/（m2·s）的光以及氮濃度限制條件下培養，其油脂含量和多不飽和脂肪酸含量都會進一步提高。在較高的光強下靜置培養，該藻可以自身氣浮。[結論]該藻具有產油微藻的潛力。

關鍵詞 Chlamydomonas sp.PD-4;生化組成;油脂含量;脂肪酸組成

中圖分類號 Q949.93 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2020）03-0058-03

Abstract [Objective]The research aimed to evaluate the possibility as a candidate for biodiesel production of a green algae Chlamydomonas sp.PD4. [Method]The basic biochemical composition， the capability in the growth， the lipid accumulation and the carbon chain composition of main fatty acid of Chlamydomonas sp.PD4 were studied，the flotation of Chlamydomonas sp.PD4 was also studied.[Result]The algae accumulated 25.81% protein，18.82% total lipid and 23.50% carbonhydrate after 9 d cultured in 100 μmol/（m2·s） radiation. The algae were cultured under the conditions of light of 200 μmol/（m2·s） and nitrogen concentration， and the oil content and polyunsaturated fatty acid content were further improved.The algae was cultured in a resting place at higher light intensity， and the algae could float on its own.[Conclusion]The algae is a valuable and useful oleaginous algae.

Key words Chlamydomonas sp.PD4;Biochemical composition;Lipid content;Fatty acid composition

微藻能源是最具有發展潛力的生物能源之一[1]。目前大規模培養微藻生產油脂仍存在2個重要的限制因素：一個是微藻油脂的產率相對較低，另一個是微藻生產和采收成本較高[2]。提高藻種生物量和油脂產量，或用產高附加值產物的藻株生產生物柴油，選擇便于采收的藻株，是降低微藻油成本較為理想的途徑。該研究探討了一株篩選自青島平度澤河中的衣藻。該藻在采樣水體中處于優勢地位且易于氣浮分布于水體表面。通過對該藻生長、產油性狀以及自氣浮特性的觀察初步判斷該藻是否具有產油藻的潛力，為后續研究類似藻株（自身氣浮）作為產油藻株提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的獲取

在平度澤河與秀水河交匯處取樣。將部分水樣離心、用滅菌蒸餾水洗滌、稀釋后通過平板分離獲得純種藻株PD-4。

1.2 藻株的分子生物學鑒定

取20 mL培養的藻細胞5 000 r/min離心5 min，收集藻細胞。將藻細胞于液氮中研磨后轉入1.5 mL離心管。使用TIANGEN植物總DNA試劑盒（TIANGEN）提取基因組DNA，操作方法按照試劑盒說明書進行。

DNA經PCR擴增，回收試劑盒（OMEGA）純化，連接至pMD18-T質粒載體（TaKaR）上，轉化后篩選陽性菌落到上海桑尼生物技術有限公司測序。向NCBI提交測序結果，搜索同源序列。

1.3 該藻基本生化組成的測定

將處于對數期的藻接種在柱狀光生物反應器中（3 cm×30 cm，玻璃材質），通氣、全光照培養，通氣量為0.2 V/V·min，CO2含量為1%。光照強度為100 μmol/（m2·s），培養溫度為（25±1）℃。

培養9 d后，將藻樣離心（Beckman離心機，美國Beckman公司）、蒸餾水清洗3次，凍干（低溫冷凍干燥機，北京博醫康）。

蛋白質含量的測定通過Vario EL元素分析儀（德國Elemtnar公司）測定N的含量（%），蛋白含量為 N×6.25[3]。

總糖按照蒽酮比色法測定[4]。

總脂測定見文獻[5]。

1.4 該藻在不同培養條件下的產油性狀

將處于對數期的藻種接種在柱狀光生物反應器，通氣、全光照培養，初始接種量為0.15 g/L，通氣量為0.2 V/V·min，CO2含量為1%，培養基為BG11，其中一組NaNO3濃度有所改變。詳見表1。

1.5 該藻氣浮現象的觀察

取一定量的藻細胞，接種于含150 mL BG11培養基的250 mL三角瓶中，于200 μmol/（m2·s）光強處靜置培養，觀察該藻能否懸浮分層。

另外，將三角瓶中自氣浮的藻（上層）和沉淀到容器底部的藻（下層）分別收集，用透射電鏡對上下層藻細胞進行結構觀察。電鏡樣品制作方法見文獻[6]。

2 結果與分析

2.1 藻株鑒定

經Blast檢索，結合細胞形態，判斷試驗藻株PD-4為Chlamydomonas sp.。向NCBI提交18sDNA堿基序列后，該藻株序列獲得的登錄號為JQ247307。

2.2 該藻基本生化組成

該藻經全光照培養9 d，其體內的蛋白質含量最高，為25.81%±0.69%，其次是總糖，為2350%±1.15%，油脂最低，為18.82%±0.73%。僅從蛋白、油脂、多糖含量來講，這株藻稍顯平庸。

2.3 該藻產油性狀分析

從綠藻Chlamydomonas sp.PD-4在不同條件下的產油性狀（表2）可以看出，經過9 d的培養，Chlamydomonas sp.PD-4油脂含量為18.63%～26.19%，油脂產率為68～116 mg/（L·d）。與一些公認的含油量和油脂產率較高的藻株（表3）相比，其油脂含量和產率并不低，表明該藻株具有作為產油微藻的潛力。

2931%、11.08%、5.14%，另有6.14%的未定性脂肪酸。脂肪酸主要是由C16和C18組成，這與柴油分子15個左右的碳鏈極其相似[8]。該藻油脂含有較高含量的油酸（C18∶1）。較高含量的油酸增強了生物柴油長期儲存的氧化穩定性[9]，降低了其在寒冷地區使用時的冷濾點（CFPP）[10]。因此，Chlamydomonas sp.PD-4抽提的油脂適用于高品質的生物柴油的生產。

2.4 該藻自氣浮現象

該藻在較高的光強（200 μmol/（m2·s））下靜止培養3 d就可以觀察到該藻在液面處漂浮了一層，到了第12天，藻體基本都懸浮到水體的上層。透射電鏡的結果顯示（圖1），上層細胞和下層細胞的結構有明顯的區別。下層細胞具有莢膜，細胞內有較多的淀粉粒;上層細胞基本沒有莢膜結構，含有較多的油滴。細胞構成的變化可能是這些藻懸浮的重要原因，而該藻在特定階段易于懸浮的特性便于采收。

在敞開的玻璃容器中培養該藻同樣觀察到自氣浮現象，并且沒有觀察到雜藻污染;在河道采集地某些靜水區域該藻長期占據絕對優勢并在水體上層形成厚厚的一層。在規模培養中，藻易受捕食者和病原體的侵擾，形成雜藻、原生動物等污染，導致群落更替或被原生動物取代等[11]。該藻在野外能夠長期占據優勢，表明該藻對環境適應性強，對病蟲害的抵抗力強，這個特點也使其比較適合大規模培養。

3 結論與討論

該試驗研究了綠藻Chlamydomonas sp. PD-4基本的生化組成以及不同培養條件下該藻的生長、油脂含量以及脂肪酸組成，并且觀察了該藻的氣浮現象。結果表明，該藻在100 μmol/（m2·s）培養9 d可產25.81%蛋白、18.82%油脂以及23.50%糖;該藻在200 μmol/（m2·s）的光以及氮濃度限制條件下培養，其油脂含量和多不飽和脂肪酸含量都會進一步提高;在較高的光強下靜置培養，該藻可以自身氣浮。這表明該藻具有產油微藻的潛力。

Chlamydomonas sp. PD-4因其它生長快、油脂含量較高、采收方便、對污染抵抗力強等特點具有一定的培養價值，也具有一定的潛力來做進一步的研究。現有篩選產油藻株時，通常只關注了生長速度、含油量這2個最核心的相關參數，對于藻的其余性狀則關注不多。通過該研究可知氣浮于液體表層的藻不僅含有較高的油脂含量（油滴較多），而且該性狀便于藻類收集，在一定程度上可能用于產油藻的篩選。

參考文獻

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