神經元特異性烯醇化酶免疫放射分析藥盒的優化

魏冰雪

（北京北方生物技術研究所有限公司，北京 100076）

1 研究背景

目前NSE被認為是腦損傷和非小細胞肺癌的一項高特異性和敏感性的生化指標，對小細胞肺癌患者和顱腦損傷病人的早期診斷、病情監測、療價評價有重要價值[1-2]。

2 材料和方法

2.1 主要儀器與試劑 伽馬計數器為西安核儀器廠產品；NSE抗原（購自HYTEST公司）、標記NSE單抗（購自Medix Biochemica公司）、包被NSE單抗（來自北京北方生物技術研究所有限公司）、放射性Na125I溶液（購自PE公司）、新生牛血清（購自蘭州民海生物工程有限公司）、法國CISBIO公司NSE免疫放射分析藥盒。

2.2 實驗方法

2.2.1 標準品配制 用100%新生牛血清將NSE抗原配制成0、5、25、50、100、200 ng/mL，4 ℃保存。

2.2.2 NSE抗體包被管制備 用pH=7.4 PBS配制含有一定濃度的NSE單抗包被液，向每管六角花試管中加入250 μL包被液，室溫過夜，抽干，再加入0.5 mL封閉液（5%蔗糖，0.1%NaN3，pH=7.4 PBS），室溫放置4 h，抽干封閉液，真空干燥，4 ℃保存。

2.2.3125I-NSE標記物制備 用50 μL 0.05 M PB溶解50 μg NSE單抗，加入4.5 mCi Na125I 溶液，搖勻，加入10 μL 2.0 mg/mL氯胺-T溶液，搖勻，反應1 min，再加入10 μL 4.0 mg/mL偏重亞硫酸鈉，搖勻，反應1 min，終止反應，用G50分離柱分離，檢驗合格后分裝，分裝時保證每200 μL125I-NSE標記物每分鐘放射性計數（CPM）為320000左右，4 ℃保存。

2.2.4 放免分析程序與數據處理方法 取50 μL NSE標準品或樣品加入NSE抗體包被管中，加入200 μL125I-NSE標記物，37 ℃水浴3 h，反應平衡后吸棄反應液（除總T管），每管加入2 mL蒸餾水洗滌4次，吸凈試管中的液體，在γ計數器上測定各管的1 min放射性計數。采用以標準品濃度為橫坐標，以CPM值為縱坐標，以Log-log直線回歸制作標準曲線，最后計算出樣品中NSE的含量。

3 結果

3.1 NSE抗體包被濃度的選擇 將NSE抗體配制成1.5 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL三個濃度，按 250 μL/管包被，做標準品的零點及首末點。結果表明：當NSE抗體濃度達到2 μg/mL時，B0/T%、B1/B0%、B5/B0%分別為0.24%、2.24%和77.13%，比例恰當，最終選擇NSE抗體包被濃度為2 μg/mL。

3.2 反應時間的選擇 選擇1、2、3 和4 h四個反應時間進行室溫震蕩，同時做標準品與臨床樣本，結果見表1。結果表明: 當反應時間達到3 h時，B0/T%、B1/B0%、B5/B0%達到平衡點，且樣品的測值穩定，最終選擇反應時間為3 h，即反應條件為室溫震蕩3 h。

表1 反應時間的選擇

3.3 標準曲線 通過方法學建立，得到的標準曲線。測量范圍為5-200 ng/mL，標準曲線方程為Y=0.9652X+2.7887，r2=0.9999。

3.4 靈敏度 同時測定20個“零”標準的計數，計算均值x和標準差s，求出x+2s值，并將此值代入標準曲線方程，計算出對應的濃度為0.5 ng/mL，即為此方法學的靈敏度。

3.5 系統比對 改進后藥盒與法國CISBIO公司NSE藥盒同時測量50份血清樣品，并對測得的NSE值進行比較。結果表明，本方法與CISBIO公司NSE藥盒的相關性方程為Y=0.9681X+0.7939，相關系數r2=0.974。

3.6 穩定性 使用37 ℃保存3 d、4 ℃保存3 d的藥盒、新制備藥盒，同時測試10份濃度不同樣本，使用配對t檢驗，P＞0.05表示測值無顯著差異。

4 討論

改進后藥盒，檢測范圍內線性關系良好，靈敏度為0.5 ng/mL，熱穩定性良好，與法國CISBIO公司NSE藥盒同時測定50份樣本，結果的相關系數r2為0.974。