體外診斷試劑校準品溯源工作現狀分析

梁春瀅，李小江，陳虹蓁

（廣東省藥品監督管理局審評認證中心，廣東 廣州 510080）

根據計量學溯源標準給出的定義，校準品是具有在校準函數中用作獨立變量值的參考物質[1]。而現行法規《體外診斷試劑注冊管理辦法》從產品預期使用風險的角度，對體外診斷試劑校準品明確了分類管理，即與二、三類體外診斷試劑配合使用的校準品，則按對應試劑的類別進行管理，與一類試劑配合使用時，要按二類產品管理[2]。然而，即便法規賦予的風險管理類別有所不同，其賦值準確度和實現計量學溯源的要求卻是等同的。因此，體外診斷試劑校準品生產企業均應嚴格根據分析物特點和國內外指南及標準承擔起校準品的量值溯源研究工作。

近年來，試劑廠家明顯重視和規范產品校準品的溯源工作，這得益于法規體系的不斷完善和與國際標準接軌進程的推進，從監管和技術兩方面促進了該項研究工作的發展。

1 從法規層面明確溯源工作的要求

現行《體外診斷試劑注冊管理辦法》中有明確規定：中國食品藥品檢定研究院負責組織國家標準品、參考品的制備和標定工作[2]，當中對國家標準品的制定工作明確了責任主體和提出了要求，從而推進了國家標準品的制備工作，為校準品溯源提供參考物質基礎。另外，國家食品藥品監督管理總局在2014年發布的第44號文中明確提出：校準品應提交完整的溯源性文件。由此，作為上市前評估校準品有效性的證明性文件，生產企業則不可避免地重視起校準品的溯源工作。

2 國內外標準實施規范了溯源工作

國際標準化組織于2003年發布實施ISO 17511體外診斷醫療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質賦值的計量學溯源性、ISO 18153體外診斷醫療器械：生物樣品中量的測量：酶催化濃度校準物質和控制物質賦值的計量學溯源性等標準，有利于指導和規范各國標準物質的計量學溯源工作。而國內也對上述兩個標準進行了轉化，于2008年開始實施GB/T21415-2008體外診斷醫療器械 生物樣品中量的測量 校準品和控制物質賦值的計量學溯源性，另外YY/T0638-2008體外診斷醫療器械 生物樣品中量的測量 校準品和控制物質中酶催化濃度賦值的計量學溯源性、JJF1059.1-2012測量不確定度評定與表示、YY/T1455-2016應用參考測量程序對酶催化活性濃度賦值及其不確定度評定指南等相繼發布，不僅對量值的傳遞途徑進行了規范，還對具體賦值的不確定度等內容提供了研究方法。

3 溯源工作研究情況

基于國內外標準的支持，從校準品廠家提供的注冊申報資料-溯源性文件可以看出，廠家對校準品計量學溯源的認知有所提高，研發過程基本能依據計量學溯源標準和相應指南逐步規范溯源性文件。目前生產企業主要依據GB/T21415-2008來開展校準品溯源工作的研究，下面則從溯源文件中包含的三部分內容來闡述校準品廠家的溯源工作情況。

3.1 校準傳遞方案的選擇 通過對校準品的溯源性文件分析得知，目前相當一部分校準品廠家會選擇GB/T21415-2008標準中5.6的情況[1]進行溯源，即溯源鏈的終端為制造商選定的測量程序，即便分析物已經有國際約定的參考物質或參考方法。選擇此方案一方面是廠家從可獲得性和成本方面考慮，但從量值傳遞本身而言，會帶進更多系統和操作因素的影響（因為廠家未必都完全了解選定的測量程序），不利于賦值和不確定度的評定，為保證校準品量值的準確性和互換性，應盡可能溯源至分析物現行的最高計量級別；另一方面原因是客觀存在的，分析物目前國際尚無約定參考物質和參考方法，在計量水平上只能溯源至選定的測量程序，以自身抗體相關分析物較為常見。

另外還有較為普遍的情況是，分析物如國家已明確了具體的參考方法或有標準物質的，廠家一般能選擇其作為溯源鏈的終端，如《全國臨床檢驗操作規程》中有明確，血紅蛋白的結果無論采用何種原理檢測，均應溯源至ICSH推薦的氰化高鐵血紅蛋白分光光度法[3]，而WS/T341-2011血紅蛋白測定參考方法中則詳細介紹了該參考方法。另外衛生部頒布很多如WS/T417-2013 γ-谷氨酰基轉移酶催化活性濃度測定參考方法、WS/T349-2011 α-淀粉酶催化活性濃度測定參考方法等標準均有指定了具體分析物質的參考方法。因此，校準品廠商在研發階段可根據分析物具體的情況，盡可能結合臨床實驗室中的校準方案、相關標準及參考物質可獲得性等方面去選擇校準傳遞方式，從而建立和保證分析物的計量學溯源。

3.2 賦值及測量不確定度的研究 標準GB/T21415-2008指出：校準品應具有賦值和已知的測量不確定度[1]，也可理解為在量值傳遞過程每一級別的校準品均應有對應賦值結果和測量不確定度。通常，廠家申報的校準品在溯源鏈中屬于產品校準品的等級，也是提供給終端客戶如醫院實驗室用來校準檢測系統用。目前國產已注冊的校準品預期用途基本是明確與廠家自己的檢測系統配套使用，故賦值和不確定度通常圍繞常規測量程序（配套的體外診斷試劑和檢測儀器）來進行研究，相應地用戶在使用過程根據說明書預期用途，局限在對配套的檢測系統進行校準，這也是國內商業化校準品的短板，目前校準水平尚未達到如朗道、伯樂等知名廠商的校準品，其賦值結果可校準不同的測量系統。這除了與校準品的計量學溯源有關外，還與校準品原材料的穩定性和純度密切相關。

本部分闡述的賦值，是對產品校準品的賦值，是用高一級參考物質校準常設測量程序后，用該常設測量程序檢測產品校準品得到一組結果，該結果可通過統計學處理（中位數或均值等）或修正最終成為固定的量值，而測量不確定度則是表征該量值分散性的非負參數[4]，在臨床上可以用來表征檢測真值的分布范圍，對于輔助臨床檢驗結果的解釋具有重要意義。另外根據標準GB/T21415-2008要求：制造商應提供賦值的不確定度[1]，因此，廠家除了提供校準品具體的量值外，還應報告該賦值下的測量不確定度，以保證臨床檢驗結果的準確性。從注冊申報的溯源性文件可知，目前廠家均能提供賦值和測量不確定度研究的具體過程，但針對不確定度的研究與相關標準和指南的要求尚存在一定差距，主要體現以下方面：（1）未明確不確定度的評定方法：不確定度的評定方法有“GUM”法、“自上而下”法、“蒙特卡洛”（MCM法）等，目前大部分廠家會選擇前兩種方法，評定方法通常與測量模型、數據分布情況有關。基于“GUM”法的具體研究流程可以參考標準JJF1059.1-2012，MCM法則可參考標準JJF1059.2-2012來評定。目前提供的不確定度研究資料中，最為典型的情況是研究方案中未明確評價不確定度所使用的方法，而直接得出校準品的測量不確定度=校準品賦值過程標準差的結論。（2）片面識別和錯誤歸類測量不確定度的來源：測量不確定度通常由多個分量組成，是基于正確定義被測量物質后（包括組分、制備方法和檢測原理等），識別整個測量過程的影響因素，進而將重要的影響因素作為不確定度的來源，貢獻量小的因素忽略不計的過程。識別不確定度來源的原則是不遺漏且不重復，獲取不確定度的分量主要步驟為：①采用因果圖作為識別工具來確定各不確定度分量的來源；②將納入的不確定度來源進行分類評定（即標準不確定度A類評定和B類評定）；③根據不同分類采用不同的方法或測量模型量化具體的不確定度分量。目前廠家識別測量不確定來源不充分主要體現在未針對被分析物和測量流程考慮影響因素，如所有的分析物均只考慮校準品的不均勻性和不穩定性引起的不確定度，未充分考慮測量分析前對分析物的制備、分析中測量系統操作和分析后數據修約和統計等引起的不確定度。另外，在衛生部標準關于不確定度評定指南中有提及，酶類分析物基本都應考慮溫度和pH兩個分量作為不確定度的來源[5]。

此外，溯源性文件存在的問題還體現在容易錯誤歸類不確定度的來源，主要原因是對標準不確定度A類評定和B類評定定義理解不準確，或認為歸為B類評定后可以避免大量復雜的統計工作，直接可參考經驗數據等信息即可，這樣往往導致計算不確定度分量時的結果差別較大。

3.3 互換性研究 為了實現不同常規測量系統間測量臨床樣本的結果具有可比性，也為了判斷校準品量值的正確傳遞，制造商需要在溯源工作中進行校準品的互換性研究。根據溯源性文件中的互換性研究情況分析，主要總結以下兩方面：（1）互換性的判斷標準各異：評價兩個測量程序之間的測量結果是否具有互換性，首先應確定互換性的判斷標準。而從資料可知各廠家依據的判斷標準有所不同，大致可歸納為：①依據EP9-A3指南，經校準品校準后的常規測量程序與參考測量程序測量的兩組測量結果之間是否具有顯著性差異來判斷；②根據EP14-A3或《WS/T356-2011基質效應和互通性指南》，校準品的測量結果是否落在參考測量程序和常規測量程序檢測結果回歸方程的95%預測區間內；③依據IFCC互換性評價更新方案，校準品在參考測量程序和常規測量程序間的偏移±不確定度是否小于該項目的醫學允許偏移[6]。上述判斷標準選擇均有一定的依據，但也有研究表明，相同的分析物如用不同的標準進行判斷時，會出現不同的結論，目前EP14-A3、IFCC方案的評價標準是臨床實驗室中較為常用的判斷標準。（2）驗證互換性的樣本考慮不足：根據標準GB/T21415-2008的要求，互換性應使用參考測量程序和常規測量程序同時檢測一組相關的人體樣本，以評估校準品的互換性。目前廠家選擇樣本存在的問題主要體現在：①選擇的樣本為添加純品的樣品，非標準要求的天然真實樣本；②樣本例數無統計學意義；③樣本濃度分布過于集中，未覆蓋測量系統的可測量范圍；④重復使用賦值過程的一組人體樣本來進行互換性研究；⑤未經評估而選擇大量凍存樣本。

4 改進建議

針對文中提及校準品溯源工作現狀的不足及校準品校準測量系統的局限性，提出以下建議供參考：（1）生產企業盡可能收集和學習計量學溯源相關標準和指南文件：目前的標準和指南基本比較完善，針對比較復雜的研究與統計方法附錄已給出對應的例子作為對照理解，可操作性更強。另外更有專有產品的對應指南供作參考，如酶類物質，因此，校準品生產企業基本能從標準和指南中得到具體的規范指導。（2）校準品應溯源至當前最高計量水平，提高校準品的量值準確度：目前部分廠商的溯源工作還停留在為符合注冊審評審批的最低要求，出于成本和縮減上市時間考慮，往往選擇市面普通的上市同類產品測量系統作為溯源的終端，會造成校準品水平參差不齊，且局限在校準本檢測系統中使用，甚至到臨床使用中出現檢測結果互換性不過關的情況。因此，建議針對該情況，如校準品不能溯源至國際單位制（SI），也盡可能選擇最高參考物質或參考方法作為溯源終端，另外選擇參考物質應來源正規，保證參考物質的正確性。（3）建議生產企業積極參與到臨床實驗室的室間評價工作：據了解，國內已有不少生產企業積極參與到臨床實驗室的室間評價工作中，這對驗證產品檢測結果準確性和提高企業檢測能力具有重要的意義，尤其對計量學溯源過程不確定度評定析、互換性評價等方面獲得臨床使用上的指導意見。（4）建立收集用戶端校準結果的數據庫：建議生產企業借鑒知名廠家的做法，開發常規測量系統時能考慮自動收集臨床用戶端使用過程的校準、質控數據，或為客戶端定期進行校準等方面的數據，集成一個回顧性分析數據庫，對以后評估測量系統的檢測水平和不斷分析改進提供研究和分析基礎。