分析育齡期女性FMR1基因突變攜帶頻率采用熒光PCR合并毛細管電泳法的應用效果

楊雪

（貴陽市婦幼保健院優生遺傳科，貴州 貴陽 550001）

在男性和女性新生兒群體中，脆性X染色體綜合征（FXS）是最常見的一種遺傳性智力低下疾病，其中男性與女性患兒的發病率分別為1/2000和1/4000，該疾病的發病率在新生兒遺傳疾病中的發病率僅次于唐氏綜合征（1/1000）[1]。據臨床結果顯示，脆性X染色體綜合征發病時經常會出現重度智力低下、大耳朵以及大下巴等表現。由于該疾病不僅是一種單基因遺傳病，而且殘疾率非常高，因此嚴重影響新生兒的生命安全及生存質量[2]。脆性X染色體綜合征的致病基因源于X染色體長臂上的脆性X智力低下1號基因（FMR1），當該基因中發生CGG重復且擴增異常以及高度甲基突變的情況時，FMR1會因此轉錄沉默，進而影響脆性X智障蛋白（FMRP）的生成。FMRP是一種促進神經發育的主要蛋白之一，該蛋白的缺乏能夠誘發嚴重性智力障礙。對于正常人來說，FMR1基因CGG的重復次數一般在6-14次左右，而當CGG重復次數在200次以上且FMR1發生甲基化時，患兒的FMR1基因便會產生全突變[3]。本研究針對育齡期婦女FMR1基因突變攜帶頻率進行相關研究，旨在探究FMR1基因功能以及調控的基礎，并為日后產前檢查是否將其列入產前篩查提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院針對該項研究共選取200例于2016年7月-2019年7月進行產前檢查的育齡期婦女作為研究對象，采取所有研究對象的外周血進行標本檢驗，并與同期已確診的6例突變攜帶者進行比較。所有接受檢查的研究對象均已對研究內容有詳細了解，且在自愿條件下簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA 利用DNA提取試劑盒（德國QiaGen公司）對標本進行基因提取，取其溶解后1 μL DNA溶液，與等量的蒸餾水進行比較，當檢測DNA純度合格后，將其濃度稀釋至20 ng/μL并備用。

1.2.2 PCR反應 利用AmplideX FMR1 PCR Kit試劑盒對其進行擴增，同時按照說明書內容對CGG重復引物聚合酶反應進行分析，其擴增后的產物需利用3730DNA分析儀實施毛細管電泳，并利用GeneMapper 4.0軟件進行片段分析。

1.3 觀察指標 觀察樣本中的CGG重復數、最大頻率等位基因數及其所占比例。

2 結果

本研究的200例受試者中，CGG重復數范圍為21-44；最大頻率等位基因數分別為32、39，其所占比例分別為32.65%與39.78%。其詳細情況見表1。

表1 標本檢驗結果

3 討論

有研究資料顯示，在FMR1基因5'非翻譯區的基因中，已有的脆性X綜合征會產生影響，在正常群體中，CGG的重復序列個數在55個以下，當其個數超過50個時，將出現異常狀況，依據序列的重復個數，可將其分成兩種類型，即前突變及全突變，在前途變中，（CGG）n的重復個數在55-200個間，與智力問題不存在聯系，但是，當患者原發性卵巢發育不全與脆性X有關時，前突變會對其產生影響，同時還能夠在與脆性X相關的震顫共濟失調綜合征中發揮作用，所以，以育齡期女性作為研究對象，對其展開FMR1基因突變攜帶水平的探究，對其生育的正確指導具有重要意義[4]。

目前，研究者在對FMR1基因的克隆復制進行研究的同時，也對脆性X綜合征的分子病理作用機理進行了闡述，且臨床上的細胞遺傳學的診斷已經被分子診斷所代替，其中分子診斷學就包括兩種方式，如PCR檢測（CGG）n重復序列個數的技術以及Southern印跡雜交技術檢測。在臨床上，使用率最高的檢測方法是（CGG）n擴增和CpG島的甲基化[5]。實際使用中，研究者發現（CGG）n擴增能夠簡便、迅速、經濟的對目標進行篩查，并且對篩查目標具有特異性，適合使用在篩查范圍較廣的人群中。CpG島的甲基化可對患者進行篩除診斷或者對患者的疾病進行確診。PCR作為一類分子生物學技術，在臨床和科研工作中可發揮重要作用，且在脆性X染色體綜合征上，該技術已經得到了廣泛運用，早在1990年時期，就有研究者運用PCR檢驗手段來監測（CGG）n的重復序列個數，后來又有眾多的學者對該技術的運用進行研究，結果顯示，在檢測正常的等位基因和大多數的前突變基因時，PCR技術的運用效果較為良好，可廣泛的運用，但是在技術層面上，對大多數的前突變和全突變基因的擴增進行檢驗時，會存在一定的難度[6]。

本研究結果顯示，最大頻率等位基因數分別為32、39，其所占比例分別為32.65%與39.78%，這或許是由于采用的DNA擴增或檢測方法的類型不同所造成的。但也可能也與研究對象（CGG）n重復序列個數分布特點的獨特性存在關聯。

綜上所述，本研究將本院育齡婦女作為研究對象，使用熒光PCR結合毛細管電泳法的方法，檢測FMR1基因突變的情況。檢測所得出的結果與國內外的參考文獻稍有不同，我們推測這或許是因為此次搜集的標本數量少，所以研究結果存在一定的缺陷，期望未來有大樣本、多中心的探究。