益氣養陰方對Lewis 肺癌移植模型小鼠免疫重塑相關因子表達的影響

胡丹丹 楊國良 陳素珍 樓黎明 張 弘

肺癌是臨床常見惡性腫瘤，氣陰兩虛為肺癌主要的中醫證候特點，益氣養陰治法則為中醫治療肺癌的重要治療原則[1-2]。益氣養陰方為已故中醫腫瘤專家施志明教授的經驗方，主要功效為益氣養陰，解毒散結。臨床觀察表明，其可延長肺癌患者生存期，緩解臨床癥狀，改善生活質量，并可在一定程度上提高機體免疫力[3-4]。前期實驗研究表明，益氣養陰方可減少CD4+CD25+Treg 細胞分化，抑制Lewis 肺癌移植小鼠腫瘤生長[5]。本實驗進一步探討益氣養陰方對Lewis 肺癌移植模型小鼠免疫重塑相關因子白細胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）表達的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 近交系C57BL/6 純系小鼠30 只，6～8 周齡，體質量18～20g，購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002。動物飼養和實驗操作在浙江中醫藥大學動物實驗研究中心進行，使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184。實驗動物管理及福利倫理審查決議編號：ZSLL-2017-132。

1.2 實驗瘤株 小鼠Lewis 肺癌瘤株，購于中國醫學科學院。

1.3 中藥復方 中藥復方益氣養陰方由生黃芪、白術、北沙參、麥冬、七葉一枝花、山萸肉、仙靈脾等組成。方藥選取及制備由浙江中醫藥大學附屬第三醫院中藥房提供。加水煎煮提取2 次后過濾、沉淀，濃縮成每亳升含生藥2g 的濃度，4℃冰箱保存。

1.4 主要試劑和儀器 Nivolumab（MCE，批號160681000140101）；BCA 法蛋白定量試劑盒（Multisciences，目錄號PQ0011）；Mouse IL-10 ELISA Kit（Multisciences，批號121071151）；Mouse TGF-β ELISA Kit（Multisciences，批號128171045）；酶標儀（Thermo Multiskan MK3，Thermo），渦旋振蕩器（Vortex KB3，Kylin-Bell）等。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備 小鼠Lewis 肺癌瘤株由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心傳代保種，待瘤體長至直徑1～1.5cm 時，處死小鼠，選擇生長良好的瘤組織，剪成瘤組織小塊，用200 目不銹鋼篩網摩擦，過濾制成密度為1×106/mL 瘤細胞懸液，于每只造模小鼠右腋下接種0.2mL 細胞懸液，全程無菌操作。

2.2 分組及干預 造模后，待腫瘤增殖至可觸及時，將小鼠按隨機數字表法分為模型組、中藥組及西藥組，每組10 只。模型組只予造模，不予藥物干預。中藥組給予灌胃益氣養陰方懸液（生藥含量2g/mL），1天1 次，0.4mL/次，給藥劑量均根據人鼠體表面積折合法計算。西藥組將Nivolumab 按照0.273mg/10g 溶于0.2mL 生理鹽水中腹腔注射，每2 周1 次。各組均常規喂食。造模第2 天就開始給藥，給藥3 周。造模第7 天開始觀察記錄各組小鼠瘤體大小（每3 天測1次瘤體大小）。

2.3 樣本制備 各組小鼠脫頸椎處死，快速完整剝離腋窩皮下腫瘤瘤體，標重后置于液氮中后保存于-80℃冰箱中備用。

2.4 檢測指標及方法

2.4.1 繪制腫瘤體積變化曲線 自造模第7 天起，每3 天用游標卡尺測一次小鼠皮下腫瘤長短徑，計算腫瘤體積。腫瘤體積（V）=腫瘤長徑×腫瘤短徑2/2；取均值繪制腫瘤體積變化曲線。

2.4.2 測定抑瘤率 3 周后脫頸椎處死小鼠，完整剝離腋窩皮下腫瘤瘤體，采用電子天平精確稱取瘤重以及去除腫瘤后的小鼠體質量并計算抑瘤率。抑瘤率=［（對照組平均瘤重-用藥組平均瘤重）/對照組平均瘤重］×100%。

2.4.3 ELISA 法檢測各組腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達 制備腫瘤組織勻漿，Bradford 法測定蛋白定量。分別按Mouse IL-10 ELISA Kit 及Mouse TGF-β ELISA Kit 說明書進行操作。

2.4.4 Westem blot 法檢測各組腫瘤組織Foxp3 蛋白表達 蛋白抽提，Bradford 法測定蛋白含量；根據蛋白定量結果，加入相應體積的總蛋白樣品，于100℃水浴3min 后上樣進行SDS-PAGE 電泳；電泳結束后，濕轉移法將蛋白條帶轉移至PVDF 膜上；3%BSA 溶液封閉后，加入Foxp3Ⅰ抗（1：1000），置4℃冰箱振蕩孵育過夜TBST 洗膜后，加入HRP 標記的Ⅱ抗（1∶10000）室溫反應1h TBST 洗滌后，ECL 化學發光試劑于暗室中顯影，X 光膠片曝光，拍照。

2.4.5 流式細胞術檢測各組外周血CD4+CD25+Treg細胞數量 將小鼠淋巴細胞分離液取出恢復至室溫，無菌條件下，取1mL 淋巴細胞分離液加入到合適的離心管中。取1mL 小鼠全血，與等量不含Ca2+和Mg2+的PBS 緩沖液混勻，小心加到淋巴細胞分離液液面上方。室溫下，1500rpm，離心15min。小心吸取第2 層細胞，轉移至4～5mL 不含Ca2+和Mg2+的PBS 緩沖液離心管中，充分混勻后，1500rpm 離心20min。沉淀經反復洗滌2 次即所得細胞。樣本管中加入anti-Mouse CD4 FITC 0.25μL 和anti-Mouse CD25 APC0.30μL，渦旋振蕩混勻，室溫避光孵育15min。加入1mL 固定/破膜工作液，渦旋混勻。室溫避光孵育45min。孵育結束后，無需洗滌，直接加入2mL 1X 破膜緩沖液，1500rpm，離心5min，棄上清。重復2 次。加入100μL 1X 破膜緩沖液重懸細胞，樣本管中加入抗體anti-Mouse Foxp3 PE 2.5μL，對應的對照管中加入等量的同型對照，室溫避光孵育45min。加入2mL 1X 破膜緩沖液，1500rpm，離心5min，棄上清。重復2 次。每管加入500μL Flow cytometry Staining buffer，流式上機。

2.5 統計學方法 應用SPSS 20.0 統計軟件處理數據，各項指標以均數±標準差（）表示。根據不同數據分別采用χ2檢驗、方差分析，方差齊性選用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett’s T3 法檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠腫瘤體積與抑瘤率比較 經藥物干預后，與模型組比較，中藥組及西藥組腫瘤體積增長均減慢，西藥組腫瘤體積明顯減慢，中藥組次之（見圖1）。各組抑瘤率比較，中藥組抑瘤率23.07%，西藥組抑瘤率37.55%，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組腫瘤體積變化

3.2 各組腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達比較 經藥物干預后，與模型組比較，中藥組及西藥組腫瘤組織IL-10、TGF-β 含量均降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與中藥組比較，西藥組腫瘤組織IL-10、TGF-β含量降低明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達比較（pg/mL，）

表1 各組腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達比較（pg/mL，）

注：模型組僅造模，不予藥物干預；中藥組給予灌胃益氣養陰方懸液；西藥組將Nivolumab 溶液腹腔注射；IL-10 為白介素10；TGF-β 為轉化生長因子β；與模型組比較，aP＜0.05，與中藥組比較，bP＜0.05

3.3 各組腫瘤組織Foxp3 表達比較 西藥組和中藥組腫瘤組織Foxp3 表達均明顯低于模型組（P 均＜0.05）；西藥組腫瘤組織Foxp3 表達明顯低于中藥組（P＜0.05）。見表2、圖2。

3.4 各組外周血CD4+CD25+Treg 細胞比例變化比較 外周血流式細胞檢測CD4+CD25+Treg 細胞結果顯示，西藥組、中藥組CD4+CD25+Treg 細胞比例均顯著低于模型組（P 均<0.05）；西藥組CD4+CD25+Treg 細胞比例顯著低于中藥組（P<0.05）。見表3、圖3。

表2 各組腫瘤組織Foxp3 表達比較（）

表2 各組腫瘤組織Foxp3 表達比較（）

注：模型組僅造模，不予藥物干預；中藥組給予灌胃益氣養陰方懸液；西藥組將Nivolumab 溶液腹腔注射；Foxp3 為轉錄因子p3；與模型組比較，aP＜0.05，與中藥組比較，bP＜0.05

圖2 各組腫瘤組織Foxp3 表達情況

表3 各組外周血CD4+CD25+Treg 細胞比例變化比較（%，）

表3 各組外周血CD4+CD25+Treg 細胞比例變化比較（%，）

注：模型組僅造模，不予藥物干預；中藥組給予灌胃益氣養陰方懸液；西藥組將Nivolumab 溶液腹腔注射；與模型組比較，aP＜0.05，與中藥組比較，bP＜0.05

圖3 各組外周血CD4+CD25+Treg 細胞計數

4 討論

機體免疫系統具有對抗腫瘤以及對腫瘤重新塑型的功能，后者稱之為“免疫重塑”[6]。腫瘤細胞在免疫重塑過程中可釋放大量細胞因子，如IL-10、TGFβ，后者可削弱細胞毒性T 淋巴細胞（CTL）、自然殺傷細胞（NK）的殺傷活性，逃避機體免疫監視，促進腫瘤轉移[7-8]。其中，IL-10 是參與腫瘤免疫逃逸的重要免疫抑制因子，具有雙向免疫調節特性，其介導免疫抑制機制可通過作用于不同免疫細胞亞群，多途徑發揮免疫抑制作用，促進腫瘤免疫逃逸[9]。TGF-β則是腫瘤誘導產生的免疫抑制因子，其可促進腫瘤組織血管生成、加速腫瘤細胞和細胞外基質之間相互作用，抑制機體免疫，利于腫瘤生長及加速其浸潤轉移；同時其可直接或間接作用于免疫細胞，誘導其功能缺失，幫助腫瘤逃避機體免疫監視，促進腫瘤發展[10-11]。在肺癌、前列腺癌、結直腸癌、胃癌等多種癌組織發現，Foxp3 表達與腫瘤高侵襲性及腫瘤組織Treg 細胞比例呈明顯正相關，說明Foxp3 是一種促癌因子，而對T 細胞分化的影響研究證明，Foxp3 表達與CD4+CD25+Treg 細胞分化形成有明顯的相關性[12-15]。而后者可抑制T 殺傷效應T 細胞，參與腫瘤免疫逃逸及腫瘤免疫重塑。

前期實驗研究證實，益氣養陰方聯合化療可下調CD4+CD25+Treg 細胞數量，抑制Lewis 肺癌移植小鼠腫瘤生長[16-17]。本研究結果示，中藥組抑制肺癌移植瘤生長的作用與西藥組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。中藥組可明顯降低腫瘤組織IL-10、TGF-β 含量，降低程度雖不及西藥組，但表明益氣養陰方可降低腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達，改善細胞免疫抑制狀態，進而發揮調節免疫重塑作用。同時本研究發現，中藥組可降低移植小鼠腫瘤組織中Foxp3的表達，該組小鼠外周血中CD4+CD25+Treg 細胞比例也明顯降低，說明中藥益氣養陰復方的免疫重塑作用可能是通過調節Foxp3 表達，影響CD4+CD25+Treg 細胞分化。

綜上所述，益氣養陰方可通過調節Foxp3 表達，進而調節腫瘤CD4+CD25Treg 細胞分化，降低腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達，改善細胞免疫抑制狀態，調節腫瘤免疫重塑來抑制Lewis 肺癌移植小鼠腫瘤生長。