七氟醚預處理對膿毒癥模型小鼠NALP3 炎性體的影響

章小林 陶 凡 汪國香 羅 宏

膿毒癥是機體在受到嚴重創傷、手術或者感染時，多種炎癥介質大量釋放而導致的一種全身炎癥反應綜合征，也是導致多器官功能障礙綜合征（MODS）、感染性休克（septic shock）的重要原因之一，具有較高的死亡率[1-2]。與其他感染性疾病不同，膿毒癥尚無特異性治療方法，有效治療膿毒癥是現代醫學亟待解決的問題[3]。隨著近年來對膿毒癥發病機制研究的深入，如何調控機體免疫功能，維持促炎和抗炎平衡已經成為治療膿毒癥的新靶點。炎性體（inflammasome）是一種多蛋白復合體，作為固有免疫的一部分，可識別和感受病原微生物及內源性危險信號，刺激活化胱天蛋白酶（cysteinylaspartatespecific protease，caspase），誘導白介素-1β（interleu-kin，IL-1β）、白介素-18（IL-18）、白介素-33（IL-33）等促炎性反應細胞因子分泌及多種炎性反應遞質釋放[4]。有研究認為，七氟醚作為一種新型的吸入麻醉藥物，除了誘導迅速、蘇醒快、血流動力學穩定、器官毒性小等優勢外，還能夠在一定程度上減少器官損傷，并具有調節炎癥免疫的作用，但目前對于具體機制的研究較少[5-6]。因此，本研究建立膿毒癥小鼠模型，使用七氟醚進行預處理，通過七氟醚對膿毒癥小鼠生存率和炎性體的影響，探究抗炎作用的通道，為膿毒癥的預防以及治療提供新的思路。

1 實驗材料

1.1 動物及分組 SPF 級C57BL/6N 健康雄性小鼠84 只，購于上海西普爾—必凱實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（滬）2015-0016。小鼠飼養環境：置于溫度（22±1）°C，濕度（60%±10%），光照（12h 照明，12h 黑暗交替）環境下飼養1 周，自由飲水、普通顆粒飼料喂養。

1.2 藥品 吸入用七氟醚（sevoflurane）（丸石制藥株式會社，批號5X011，規格：250mL）；三氯乙醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號30037516，規格：100mL）。

1.3 試劑和儀器 RNA 提取試劑盒（Qiagen 公司，德國，批號74106）；逆轉錄試劑盒（Thermo 公司，美國，批號EY2467）；PCR 試劑盒（天根生化公司，中國，批號28104）；瓊脂糖（Biowest 公司，西班牙）。梯度PCR 儀（abi 9700 美國），Bio-rad 微量核酸電泳系（Bio-RAD 公司），核酸凝膠成像系統（Biostep 德國），光學顯微鏡（Olympus 日本），石蠟切片機（RM2135 型德國），低溫高速離心機（Beckman 德國），Fabius 麻醉機、氣體監測儀（Drager 公司，德國），小鼠模擬七氟醚吸入箱等。

2 實驗方法

2.1 分組 采用隨機數字表法分為氧氣對照組、七氟醚對照組、氧氣膿毒癥組和七氟醚膿毒癥組，每組21 只。

2.2 小鼠膿毒癥模型（CLP）建立 參照文獻[7]，采用盲腸結扎穿刺法制備小鼠膿毒癥模型。腹腔注射2%水合氯醛15mL/kg 麻醉下，于腹部備皮消毒后，沿腹中線切開皮膚、腹壁約1cm，以無菌鑷探查到盲腸后，用手術縫線在回盲瓣下方盲腸近段1/4 處結扎，用20G 無菌針頭分別于結扎盲腸頭尾端穿孔，擠出內容物0.3mL，將盲腸和擠出物一起還納腹腔，并逐層縫合切口，術后切口碘伏消毒以防切口感染。對照組小鼠在無菌狀態下開腹找出盲腸后再將其還納腹腔，不進行盲腸結扎和穿刺，然后逐層關腹。各組術畢皮下注射0.9%氯化鈉溶液1mL 抗休克。

2.3 七氟醚氣體吸入 手術前，在22cm×12cm×15cm 自制吸入麻醉箱底鋪墊2cm 厚鈉石灰，箱體兩側分別接Fabius 麻醉機進氣、出氣管和氣體監測儀，氧流量3L/min，調節揮發罐誘導麻醉，使麻醉箱內七氟醚濃度達到5.0%，隨后放入小鼠，約2min 后小鼠翻正反射消失，調節七氟醚濃度3.0%。采用美國Kent 小動物監測儀，監測SPO2，40min 后關閉揮發罐。對照組僅吸入純氧，氧流量3L/min。

2.4 標本采集和檢測

2.4.1 小鼠生存率觀察 模型制作后每組隨機選取9 只小鼠觀察生存情況，計算生存率。

2.4.2 組織學檢查與臟器組織炎癥評分 手術后24h，各組隨機選取3 只小鼠斷頭處死，獲取肺、肝、腎組織，置于10%中性福爾馬林緩沖液，在4℃下固定24h，石蠟包埋，切片厚度5μm。將病理切片分別進行蘇木素-伊紅（HE）（北京索萊寶科技有限公司）染色，光學顯微鏡下觀察HE 染色觀察各臟器是否有炎癥反應，按照SIRS 評分標準[8]進行炎癥評分：無損傷為0 分，損傷0～25%為1 分，25%～50%為2 分，50%～75%為3 分，75%～100%為4 分，得分越高，炎癥越嚴重。

2.4.3 RT-PCR 方法檢測血液、腹腔灌洗液、肺灌洗液NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達 剩余小鼠均24h 后水合氯醛麻醉，摘眼球取血，并對各組小鼠進行腹腔灌洗及肺灌洗。灌洗液2000r/min 離心后去上清（血標本經淋巴細胞分離液分離后取單核細胞層），37℃溫箱1640 細胞培養液下培養巨噬細胞，收集細胞。取部分收集到的細胞按照Trizol RNA、提取試劑盒說明書提取總RNA，采用紫外吸收法測定其在A260nm/A280nm 的比值，在1.8～2.0 之間認為RNA 純度合格。使用TAKARA 反轉錄試劑盒合成cDNA（濃度為50ng/μL）。加樣后置入定量PCR 儀進行反應擴增。

采用Primer Premier 5.0 及Oligo 6 軟件進行引物設計，由浙江中醫藥大學提供引物合成技術。NALP3 上游引物：5'-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3'，下游引物：5'-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3'；Caspase1 上游引物：5'-GGAAGCAATTTATCAACTCAGTG-3'，下游引物：5'-GCCTTGTCCATAGCAGTAATG-3'；ASC 上游引物：5'-GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3'；下游引物：5'-CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3'；β-actin 上游引物：5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物：5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'。

PCR 反應條件：95°C 預變性10min，95°C 變性30s，60°C 30s，72°C 延伸1min，共40 個循環。所有目的基因的閾值是與內參比較，通過計算2-ΔΔCt 表示基因相對表達量。

2.5 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件對各項監測數據進行分析，數據分析結果以均數±標準差（）表示，兩組間數據分析采用t 檢驗，多組間數據分析采用單因素方差分析（ANOVA），后續分析采用LSD 檢驗，以P<0.05 表示差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 小鼠生存率觀察 7 天后，七氟醚對照組與氧氣對照組小鼠無死亡，生存率100%，而七氟醚膿毒癥組中死亡3 只，生存率66.67%（6/9）；氧氣膿毒癥組中死亡4 只，生存率55.56%（5/9）；七氟醚膿毒癥組與氧氣膿毒癥組小鼠生存率明顯低于七氟醚對照組和氧氣對照組（P＜0.05），但七氟醚膿毒癥組與氧氣膿毒癥組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3.2 各組小鼠臟器組織炎癥評分 與對照組比較，膿毒癥組小鼠肺、肝、腎組織炎癥評分明顯升高；七氟醚膿毒癥組炎癥評分明顯低于氧氣膿毒癥組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠肺、肝、腎組織炎癥評分比較（分，）

表1 各組小鼠肺、肝、腎組織炎癥評分比較（分，）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與氧氣膿毒癥組比較，bP＜0.05

3.3 各組小鼠血NALP3、Caspase-1 以及ASC mRNA 表達 RT-PCR 檢測結果顯示，膿毒癥組小鼠血NALP3、ASC、Caspase-1 表達量顯著高于對照組（P均＜0.05）；與氧氣膿毒癥組比較，七氟醚膿毒癥組小鼠血NALP3、ASC、Caspase-1 表達顯著下調（P 均＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達量比較（）

表2 各組小鼠血NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達量比較（）

注：NALP3 為核苷酸結合低聚體結構域樣受體3；Caspase-1 為半胱天冬酶-1；ASC 為凋亡相關斑點樣蛋白；與對照組比較，aP＜0.05；與氧氣膿毒癥組比較，bP＜0.05

3.4 各組小鼠腹腔灌洗液NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達量比較 RT-PCR 檢測結果顯示，膿毒癥組小鼠腹腔灌洗液NALP3、ASC、Caspase-1表達量顯著高于對照組（P 均＜0.05）；與氧氣膿毒癥組比較，七氟醚膿毒癥組NALP3、ASC、Caspase-1 表達量顯著下調（P＜0.05）。見表3。

3.5 各組小鼠肺灌洗液NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達量比較 RT-PCR 檢測結果顯示，膿毒癥組小鼠肺灌洗液NALP3、ASC、Caspase-1 表達量顯著高于對照組（P 均＜0.05）；與氧氣膿毒癥組比較，七氟醚膿毒癥組NALP3、ASC、Caspase-1 表達顯著下調（P 均＜0.05）。見表4。

表3 各組小鼠腹腔灌洗液NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA表達量比較（）

表3 各組小鼠腹腔灌洗液NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA表達量比較（）

注：NALP3 為核苷酸結合低聚體結構域樣受體3；Caspase-1 為半胱天冬酶-1；ASC 為凋亡相關斑點樣蛋白；與對照組比較，aP＜0.05；與氧氣膿毒癥組比較，bP＜0.05

表4 各組小鼠肺灌洗液中NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達量比較（）

表4 各組小鼠肺灌洗液中NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達量比較（）

注：NALP3 為核苷酸結合低聚體結構域樣受體3；Caspase-1 為半胱天冬酶-1；ASC 為凋亡相關斑點樣蛋白；與對照組比較，aP＜0.05；與氧氣膿毒癥組比較，bP＜0.05

4 討論

目前認為，過度的炎癥反應是膿毒癥發病的關鍵因素[9]。適度的炎癥反應有利于宿主消除入侵的病原體并促進組織修復。然而，如果炎癥級聯不受控制，導致促炎細胞因子的過量產生和抗炎細胞因子與促炎細胞因子之間的失衡，則會發生全身性炎癥反應綜合征（SIRS）或敗血癥[10]。有研究表明，在膿毒癥發病過程中，存在炎性體（尤其是NALP3 炎性體）的異?；罨殡S其底物IL-1β、IL-18 的顯著升高[11-12]。NALP3 是一種炎性體NOD 樣受體，能夠對機體中微生物以及細胞內自身代謝性應激進行識別和感受，介導炎癥因子的分泌和炎性介質的釋放[13]。其在受到外源或內源性危險信號刺激后，通過招募ASC 和pro-caspase-1，促進caspase-1 活化，從而使大量pro-IL-1β 轉化為成熟IL-1β 并進行分泌。IL-1β 因子通過激活IL-1 受體使趨化因子和其他炎癥調節因子發揮作用。在炎性發生時，機體中的NALP3 水平會急劇上升，然后逐漸降低，調節炎癥因子的分泌和釋放，對機體獲得性免疫反應具有重要的調控作用[14]。大量研究也表明，NALP3 的寡聚體化不僅可以促進pro-IL-1β 轉化為成熟IL-1β，還可以使caspase-1 水解產生解pro-IL-18 和pro-IL-33，促進活性IL-18 和IL-33 的產生，介導炎癥反應[15]。

七氟醚是最常用的揮發性麻醉劑，近年來七氟醚抗炎效應、緩解應激及缺血/再灌注損傷等免疫效應的研究日益得到重視[16-17]。七氟醚預處理是在臟器缺血-再灌注前分次間斷或連續吸入一定濃度的七氟醚，激活缺血心腦等器官的防御機制，發揮保護作用。Herrmann 等[5]研究表明，七氟醚預處理通過抑制炎癥反應，脂質過氧化反應及氧化應激等緩解膿毒血癥。Zhou 等[18]發現，七氟醚預處理可以通過Toll 樣受體（TLR3）信號轉導通路，上調抗炎因子和下調促炎因子的表達，減輕體外循環對腦組織的損傷。本研究結果顯示，七氟醚膿毒癥組與氧氣膿毒癥組小鼠的生存率明顯低于七氟醚對照組與氧氣對照組（P<0.05）；氧氣膿毒癥組和七氟醚膿毒癥組小鼠的肺、肝、腎組織炎癥評分明顯高于氧氣對照組和七氟醚對照組，但七氟醚膿毒癥組明顯低于氧氣膿毒癥組（P<0.05），七氟醚預處理可以有效的改善膿毒癥患小鼠的炎癥水平。進一步研究發現，與氧氣對照組和七氟醚對照組比較，氧氣膿毒癥組和七氟醚膿毒癥組小鼠的NALP3、ASC、Caspase-1 表達明顯升高，且七氟醚膿毒癥組明顯低于氧氣膿毒癥組。實驗結果與Lai 等[19]研究結果相符。

綜上所述，七氟醚預處理能有效降低膿毒癥小鼠炎癥水平，這一過程可能通過調節NALP3 炎性體的活性實現。NALP3 炎性體與膿毒癥的發生與發展具有密切關系。