Bj?rnstad綜合征致病BCS1L基因的新發突變位點研究

李思源 劉婷婷 楊淑霞 馬圣清 楊勇

北京大學第一醫院皮膚科 北京市皮膚病分子診斷重點實驗室 國家皮膚與免疫疾病臨床醫學研究中心 100034

楊勇現在中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病醫院遺傳病中心工作，南京210042

Bj?rnstad 綜合征（Bj?rnstad syndrome）又名扭曲發綜合征，是一種罕見的先天性遺傳性疾病，由Bj?rnstad于1965年首次報道，其主要臨床特征為先天性頭發扭曲和感音性聽力喪失。BCS1L為其致病基因，編碼一種泛素-細胞色素C還原酶復合體伴侶蛋白，突變后破壞線粒體呼吸小體的組裝，降低線粒體電子傳遞鏈的活性，增加活性氧的產生，使得對線粒體功能敏感的毛囊和聽覺毛細胞產生氧化應激損傷，從而表現為先天性頭發扭曲和感音性聽力喪失。BCS1L基因突變的病例主要集中在北美和北歐等地區，而國內相關報道較少。我們對收集到的1例Bj?rnstad綜合征患者進行BCS1L基因突變研究，以期進一步探究BCS1L基因突變與臨床表型之間的聯系。

對象與方法

一、對象

患者女，25歲，自出生起即頭發稀疏、扭曲且生長速度慢，頭發干枯無光澤，易斷裂，無頭皮瘙癢；眉毛稀，睫毛短（圖1）。家長述患者自幼聽力正常，無聽力障礙，12歲時為改善毛發問題，于后頸部注射不明成分的針劑長達1年，隨后突發耳鳴。聽力檢查示：雙耳聽力障礙，左耳平均聽力85.6 dB，右耳92.9 dB，屬于極重度聽力障礙，言語識別率0。體檢：一般情況良好，身高、體重、智力發育正常。血清微量元素（銅、鋅、鐵、鈣、鎂）以及生長激素和性激素檢測正常。父母否認近親婚配，其母妊娠時無特殊疾病和特殊用藥史，患者的父母、姐姐及其余家庭成員均未出現頭發扭曲或聽力障礙等癥狀。

圖1 Bj?rnstad綜合征患者臨床表現 頭發稀疏扭曲，眉毛稀疏。1A：正面照；1B：側面照

二、方法

1.外周血DNA提?。罕狙芯拷洷本┐髮W第一醫院倫理委員會批準（2016［1024］），患者及家屬簽署知情同意書后，采集患者及其父母外周靜脈血2 ml，用2%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，常規低滲溶血，酚-氯仿法提取外周血白細胞DNA。

2.聚合酶鏈反應（PCR）引物設計：根據BCS1L基因序列（來源于ensemble網站，網址：http：//asia.ensembl.org/index.html），利用NCBI primer-blast（網址 https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設計7對特異性引物，擴增患者及其父母BCS1L基因全部外顯子和側翼序列，第4號外顯子引物序列為：上游5′-CAGTACCCGTACTCAGCACC-3′，下游5′-TAGCCAAAGGGACGCCATTC-3′；第8號外顯子引物序列為：上游5′-GCCTCTCTGATGACCGACTC-3′，下游 5′-TGAGCAGTAGCCCACGTACT-3′，引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

3.PCR反應體系及條件：以PCR DNA擴增儀（Eppendorf，德國）進行PCR反應，反應體系25 μl：2 × KAPA2G Fast Genotying Mix 12.5 μl，上下游引物各1.0 μl（10 pmol/μl），DNA 1 μl（約200 ng），補充ddH2O至25 μl；擴增條件：94 ℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃適溫延伸45 s，共30個循環；最后72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，所有PCR產物經純化后送至北京天一輝遠生物科技有限公司，包括目的外顯子所有序列以及兩側至少30 bp側翼序列，經ABI3730xl全自動DNA測序儀測序，結果與Ensemble genome browse所公布的序列雙向對比，使用BioEdit sequence Alignment Editor軟件進行分析，并通過預測軟件（http：//www.mutationtaster.org/）對突變位點進行預測。

圖2 Bj?rnstad綜合征先證者及其父母的BCS1L基因突變分析 先證者BCS1L基因第4號外顯子發生c.430 C＞T雜合突變（p.R144*），第8號外顯子發生c.917 G＞A雜合突變（p.R306H）；先證者父親BCS1L基因第4號外顯子正常，第8號外顯子發生c.917 G＞A雜合突變（p.R306H）；先證者母親的BCS1L基因第4號外顯子發生c.430 C＞T雜合突變（p.R144*），第8號外顯子正常

4.電鏡檢查：用細鑷子輕取患者頭發若干根，送至電鏡室進行樣本處理并使用掃描電鏡（AmRay 1000A）檢查。

結 果

一、PCR擴增結果

以該患者及其父母的DNA為模板，7對引物均可擴增出各自產物，長度為436～714 bp。

二、DNA測序結果

患者BCS1L基因第4號外顯子上存在雜合無義突變（圖2）：第430位堿基發生C→T（c.C430T）雜合突變，使第144位密碼子CGA→TGA，導致其編碼氨基酸序列由精氨酸突變為終止密碼子（p.R144*），通過預測軟件（http：//www.mutationtaster.org/）進行預測，顯示出現無義介導的mRNA降解而致病，該預測結果高度可信（得分為1）；第8號外顯子上存在雜合錯義突變（圖2）：第917位堿基發生G→A（c.G917A）雜合突變，使第 306位密碼子CGC→CAC，導致其編碼氨基酸序列由精氨酸突變為組氨酸（p.R306H）。對先證者父母BCS1L基因進行測序，結果顯示，其父母均為攜帶者：患者父親的BCS1L基因第8號外顯子發生c.917 G＞A雜合突變（p.R306H），第4號外顯子正常（圖2）；患者母親的BCS1L基因在第4號外顯子發生c.430 C＞T雜合突變（p.R144*），第8號外顯子正常（圖2）。突變均由反向測序得到驗證。

三、電鏡檢查結果

掃描電鏡下見患者頭發以不規則的間隔出現扁平、溝槽和沿長軸扭曲，發干表面毛小皮邊緣不清、粗糙，伴部分翹起（圖3）。

討 論

Bj?rnstad綜合征為常染色體隱性遺傳，患者通常出生后不久即出現頭發異常，包括頭發扭曲，無規則扁平，生長速度慢，發質干枯無光澤，易斷裂，隨著年齡增長而加重，眉毛、睫毛亦可受累。電鏡下發干以不規則的間隔出現溝槽，繞軸旋轉，從而引起毛發的自發性斷裂，發干表面毛小皮邊緣不清、粗糙，伴部分翹起。

圖3 Bj?rnstad綜合征先證者毛發掃描電鏡圖像 3A：頭發出現扁平、凹槽和縱嵴，毛小皮邊緣不清、粗糙，伴部分翹起（×500）；3B：頭發出現沿發干長軸的扭曲（×500）

扭曲發的形成可以是先天性的，也可以繼發于各種原因的斑禿而引起［1］。先天性扭曲發亦可見于各種罕見的綜合征，如：Crandall綜合征［2］、Menkes綜合征［3］、外胚層發育不良、神經缺陷和代謝紊亂等，可通過基因測序，檢測血清銅、生長激素、性激素水平等方法鑒別。

1965年，Bj?rnstad首先將先天性頭發扭曲和感音性聽力喪失作為一組遺傳表型，報告了8例扭曲發患者，其中5例并發感音性聽力障礙，并建議扭曲發的低齡兒童應盡早進行聽力測試［4］。1998年，Lubianca Neto等［1］將 Bj?rnstad 綜合征的致病基因定位于染色體2q34-36。2007年，該課題組研究發現，BCS1L基因編碼一種泛素-細胞色素C還原酶復合體伴侶蛋白，位于線粒體內膜上，在線粒體呼吸鏈組裝中幫助Fe/S蛋白插入到復合體Ⅲ的前體中，是線粒體呼吸鏈復合體組裝所必需的伴侶蛋白［5］。BCS1L蛋白包含兩個功能域：促進線粒體內膜的易位及插入區域（1～89個氨基酸）和ATP活動相關的ATP酶家族的區域（220～399個氨基酸）。而突變基因編碼形成的BCS1L蛋白改變了蛋白之間的相互作用，增加了缺乏Fe/S蛋白插入的線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ前體的積累，破壞了線粒體呼吸小體（人類線粒體呼吸作用的基本單位）的組裝，降低了線粒體電子傳遞鏈的活性，增加了活性氧的產生。

BCS1L基因突變導致的Bj?rnstad綜合征顯示了耳朵和頭發組織對線粒體功能的敏感性，特別是對活性氧產生的敏感性，快速分裂的毛囊細胞較容易受到活性氧水平增加的影響，而已有模型支持活性氧水平對耳毒性的作用，如耳毒性抗生素對聽覺毛細胞造成的氧化應激損傷［6］等。除了僅有耳朵和毛發受累的Bj?rnstad綜合征之外，BCS1L基因突變造成的線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ的缺乏，也會導致其他廣泛的疾病表型：如神經系統疾病［7］，局灶性癲癇、肌無力和視網膜萎縮，以及更為嚴重的線粒體復合體Ⅲ缺乏癥［8］（出生時出現代謝性酸中毒、新生兒近端腎小管病變、肝臟損害和神經受累）和Gracile綜合征［9］（表現為生長遲緩、氨基酸尿、膽汁淤積、鐵超載和乳酸中毒以及早夭）等，后兩者為嚴重的線粒體疾病，是新生兒致命性疾病。

從基因學角度分析，所有BCS1L基因突變均破壞了線粒體呼吸小體的組裝，降低了線粒體電子傳遞鏈的活性，并且增加了活性氧的產生。而活性氧的產生情況與BCS1L基因突變的臨床表型嚴重程度相關。此外，BCS1L基因突變造成的表型差異也可能與線粒體的異質性、組織對能量需求的可變性以及組織對活性氧的敏感性有關。國外蛋白組學研究顯示，BCS1L蛋白存在p.I106*、p.R114W、p.R183H、p.A273fs*27、p.R291*、p.Q302E、p.R306H等改變的病人僅出現典型的Bj?rnstad綜合征特征——出生時即表現出毛發異常以及先天性聽力障礙，無其他疾病表現；當BCS1L蛋白存在p.G35R和 p.R184C［5］突變時，患者除了具有典型的Bj?rnstad綜合征特征外，還存在如生長遲緩、發育遲緩和肌張力減退等輕度線粒體復合體Ⅲ缺乏癥的表現；當患者BCS1L蛋白存在p.R56*、p.S78G、p.P99L、p.R144Q、p.R155P、p.S277N、p.V327A、p.V353M等突變時，表現出了更為嚴重的線粒體復合體Ⅲ缺乏癥和Gracile綜合征的臨床表型。患者復雜的多系統臨床表現以及早夭限制了對BCS1L基因不同突變位點及其對應臨床表型的研究。國內報道的BCS1L基因突變致病的病例［10］較少，且均為Bj?rnstad綜合征，突變位點包括p.R306C和p.R186*［11］、p.A273fs*27 和 p.R306H［12］等，而線粒體復合體Ⅲ缺乏癥和Gracile綜合征尚未見報道。

本文報告的患者自幼毛發稀疏、扭曲，但聽力正常；其聽力障礙出現時間較晚，并且有藥物誘發因素存在，而又區別于藥物中毒性耳聾的聽覺系統慢性中毒（常出現于治療后1～2周，逐漸加重）及可能的前庭系統受累（可出現眩暈和平衡失調）癥狀，本例患者的聽力障礙發生于持續用藥1年后，無漸進性加重過程，無前庭系統受累表現。對本例患者及其父母的BCS1L基因進行測序，結果顯示，患者第4號外顯子發生c.430 C＞T雜合突變（p.R144*），其母親為該突變的攜帶者；患者第8號外顯子發生c.917 G＞A雜合突變（p.R306H），其父親為該突變的攜帶者?；颊連CS1L基因第4號外顯子c.430 C＞T雜合突變（p.R144*）為該基因突變導致Bj?rnstad綜合征的新發致病突變位點，既往雖有第144位氨基酸由精氨酸突變為谷氨酰胺（p.R144Q）的報道［5］，但突變為終止密碼子的報告尚屬國際首例，通過預測軟件（http：//www.mutationtaster.org/）預測，顯示BCS1L基因第4號外顯子發生c.430 C＞T雜合突變后出現無義介導的mRNA降解，該預測結果高度可信（得分為1），推測提前終止的BCS1L蛋白出現了功能缺失而致病；第8號外顯子上的突變位點位于BCS1L蛋白的ATP活動相關的ATP酶家族功能域的外表面，既往文獻已報道該點突變影響了BCS1L蛋白與其他蛋白的相互作用，進而影響線粒體呼吸鏈ATP依賴的組裝過程，從而導致疾病的發生［5］。結合患者的毛發異常及其BCS1L基因的突變情況，診斷為Bj?rnstad綜合征，并對其不典型的聽力障礙進行報告。目前本例患者仍在隨訪中。

綜上所述，本文在既往研究的基礎上，首次報道BCS1L基因第144位密碼子CGA→TGA導致的編碼終止為該基因突變導致Bj?rnstad綜合征的新發致病突變位點，為進一步明確Bj?rnstad綜合征基因型和表型的關系積累了新證據。隨著分子遺傳學的進展，可以通過基因診斷，對患者進行預后評估，也可以通過產前診斷，阻止疾病在家族中的延續。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突