南瓜屬作物遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

韓濤 姜立娜 郭衛(wèi)麗 周俊國(guó) 陳學(xué)進(jìn)

摘 要：南瓜屬（Cucurbita）作物包括中國(guó)南瓜（C. moschata D.）、印度南瓜（C. maxima D.）和美洲南瓜（C. pepo L.）等許多重要蔬菜，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，南瓜屬作物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)普遍存在轉(zhuǎn)化效率低、重復(fù)性差、假陽(yáng)性和嵌合體干擾等諸多問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，南瓜屬作物遺傳改良和基因功能驗(yàn)證亟需建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。前人在南瓜離體再生、花粉管通道和農(nóng)桿菌介導(dǎo)等轉(zhuǎn)化方法上做過(guò)不少探索，普遍認(rèn)為以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)離體再生是最具潛力的轉(zhuǎn)化體系。筆者對(duì)現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)進(jìn)行綜述， 為促進(jìn)其在南瓜屬作物遺傳改良上的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：南瓜屬;花粉管通道法;農(nóng)桿菌;轉(zhuǎn)基因;離體再生

中圖分類(lèi)號(hào)：S642.1? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ?文章編號(hào)：1673-2871（2020）01-001-06

Abstract： Cucurbita crop includes many important vegetables， such as C. moschata D.， C. maxima D. and C. pepo L.， which are widely cultivated worldwide and have important economic values. At present， there are many problems of genetic transformation in Cucurbita， such as low efficiency， poor repeatbility， and interference of false-positive and chimeric. As the rapid development of molecular biology， it is urgent to establish an efficient and stable genetic transformation system for genetic improvement and gene function verification. Many researches have been conducted on the methods of pumpkin regeneration in vitro， pollen tube pathway and Agrobacterium-mediated transformation. It is generally believed that Agrobacterium-mediated cotyledon node regeneration is the most potential transformation system. Here we summarize the research progress in this field， providing references to promote its application in the genetic improvement of Cucurbita crops.

Key words： Cucurbita; Pollen tube mediated gene transfer; Agrobacterium; Transgenesis; Regeneration in vitro

南瓜是葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita）的重要蔬菜，包括5個(gè)主要栽培種，分別為：中國(guó)南瓜（C. moschata D.），印度南瓜（C. maxima D.），美洲南瓜（C. pepo L.），黑籽南瓜（C. ficifolia B.）和灰籽南瓜（C. mixta P.）[1]。南瓜起源于中南美洲，栽培歷史悠久，世界各地均有種植，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。南瓜果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種維生素、氨基酸和礦物質(zhì)，種子含有多種保健活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、提高肌體免疫力等功效[2]。由于南瓜植株抗逆性較強(qiáng)，常作為其他瓜類(lèi)蔬菜的砧木，用于提高嫁接苗的抗逆性、產(chǎn)量及果實(shí)品質(zhì)[3-4]。

植物遺傳轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)基因技術(shù)）是指將外源基因（目的基因）經(jīng)過(guò)體外重組，通過(guò)種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化或組織培養(yǎng)將目的基因整合于基因組，使植物獲得新的性狀并能穩(wěn)定遺傳的一系列技術(shù)[5]。遺傳轉(zhuǎn)化是植物性狀改良的重要手段，相對(duì)于傳統(tǒng)雜交方法具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，如能有效克服物種間的界限、改良性狀方向精準(zhǔn)、育種進(jìn)程短等。植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有花粉管通道法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法等。

南瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的探索起步比較晚，普遍存在轉(zhuǎn)化效率低、可重復(fù)性差等問(wèn)題。隨著南瓜屬作物基因組序列的公布[6]，南瓜基因功能研究將進(jìn)入后基因組時(shí)代，遺傳改良也將邁上新臺(tái)階，然而低效的遺傳轉(zhuǎn)化成為南瓜性狀改良和基因功能研究的主要瓶頸，因而建立高效穩(wěn)定的南瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系非常迫切。關(guān)于南瓜遺傳轉(zhuǎn)化詳盡的文獻(xiàn)綜述還未見(jiàn)報(bào)道，筆者根據(jù)現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)，對(duì)不同的遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行綜述，總結(jié)技術(shù)難點(diǎn)，分析潛在的突破口，為建立高效穩(wěn)定的南瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系提供有力支持。

1 花粉管通道法

花粉管通道法（Pollen Tube Mediated Gene Transfer，簡(jiǎn)稱(chēng)PTT）是由我國(guó)學(xué)者周光宇等創(chuàng)立[7-8]，后經(jīng)不斷改進(jìn)而建立的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。基本原理是利用受精卵發(fā)育初期易接受外源DNA分子的特點(diǎn)，以花粉萌發(fā)形成的花粉管為通道，將外源基因或含有外源基因的質(zhì)粒或農(nóng)桿菌通過(guò)柱頭涂抹、子房注入等方法使目的基因整合到受體細(xì)胞基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而獲得轉(zhuǎn)化植株。也有學(xué)者將該方法經(jīng)過(guò)改進(jìn)后稱(chēng)之為子房注射法[9]。花粉管通道法借助植物自身受精卵發(fā)育形成轉(zhuǎn)化植株，因此不依賴(lài)組織培養(yǎng)，技術(shù)簡(jiǎn)單，成本低，已得到分子生物學(xué)驗(yàn)證。該法在玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivuml）、番茄（Solanum lycopersicum）、甜瓜（Cucumis melo）、西瓜（Citrullus lanatus）等多種作物上獲得成功[10]。利用花粉管通道法進(jìn)行南瓜遺傳轉(zhuǎn)化的探索非常有限。張言朝等[11]采用子房注射法嘗試了南瓜轉(zhuǎn)化遺傳，南瓜授粉后24 h，向子房注射含目的基因的質(zhì)粒，收獲115個(gè)果實(shí)，選取56個(gè)果實(shí)的種子，幼苗經(jīng)過(guò)PCR鑒定得到7個(gè)陽(yáng)性植株，T1代經(jīng)過(guò)鑒定并未得到純合的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率僅為0.25%。轉(zhuǎn)化效率低，隨機(jī)性大，該方法能否再次獲得成功未見(jiàn)后續(xù)報(bào)道。2017年，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研發(fā)了一項(xiàng)新的基于花粉管通道的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，以磁性納米顆粒Fe3O4作為基因載體，在外加磁場(chǎng)作用下將載體顆粒輸送至花粉內(nèi)部，用該花粉進(jìn)行人工授粉直接獲得轉(zhuǎn)化種子，再經(jīng)過(guò)篩選獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因后代。該法在兩種棉花（Gossypium hirsutum）基因型中獲得了0.18%～1.00%的轉(zhuǎn)化率，在辣椒、百合、中國(guó)南瓜和美洲南瓜中嘗試，成功獲得了辣椒和中國(guó)南瓜的轉(zhuǎn)基因后代，但研究人員未說(shuō)明轉(zhuǎn)化率[12]。該技術(shù)作為一種新的嘗試，可能具有廣泛的應(yīng)用前景。

利用植物自然受精過(guò)程進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的方法還有蘸花法（Floral-dip Method），該法配合使用農(nóng)桿菌，操作非常簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率低，適合種子較多的植物，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和其他部分植物中得到廣泛應(yīng)用[13-15]，該法并不適合大多數(shù)植物，尤其是株型大、種子少的植物，后期篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株將費(fèi)時(shí)費(fèi)力。南瓜株型大，雌花子房大且壁厚，通過(guò)蘸花使農(nóng)桿菌滲透到受精卵的可能性極小，因此筆者推測(cè)該法并不適合南瓜。

盡管花粉管通道法簡(jiǎn)便，但并未成為南瓜遺傳轉(zhuǎn)化的主流方法，筆者認(rèn)為可能的原因是其轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不清楚，可重復(fù)性差，易受田間環(huán)境因素和花期影響，轉(zhuǎn)化效率低等。

2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

植物遺傳轉(zhuǎn)化中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（Agrobacterium-mediated Gene Transfer）應(yīng)用最為廣泛，幾乎所有的雙子葉植物和部分單子葉植物都適用。作為天然的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，該法具有單拷貝整合、轉(zhuǎn)化基因片段大、轉(zhuǎn)化效率高、遺傳穩(wěn)定（符合孟德?tīng)栠z傳）、較少發(fā)生基因沉默、可重復(fù)性較好等優(yōu)勢(shì)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已經(jīng)在葡萄（Vitis vinifera）、矮牽牛（Petunia hybrida）、水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivuml）、番茄（Solanum lycopersicum）、黃瓜（Cucumis sativus）等諸多植物中獲得成功[16-20]，成為植物遺傳轉(zhuǎn)化的主流方法。在南瓜遺傳轉(zhuǎn)化方面，前人的探索幾乎均采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。南瓜的離體再生、南瓜基因型和外植體的選擇、農(nóng)桿菌菌株的選擇、篩選劑的選擇、侵染方法、脫菌方法和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用等都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，筆者就從這幾個(gè)方面進(jìn)行論述。

2.1 南瓜的離體再生

高效穩(wěn)定的離體再生體系是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化的前提。和大多數(shù)植物一樣，南瓜有體細(xì)胞胚發(fā)生（Somatic embyogenesis）和器官發(fā)生（Organogenesis）兩種再生途徑。關(guān)于體細(xì)胞胚發(fā)生途徑前人做過(guò)很多研究，且多以美洲南瓜為試材。早在1995年，Carol Gonsalves等[21]就以子葉為外植體，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)11～17周后，6種美洲南瓜（又稱(chēng)西葫蘆）基因型均誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚并獲得再生苗。謝冰等[22]培養(yǎng)美洲南瓜未受精的胚珠，獲得了雌核發(fā)育的再生植株。但體細(xì)胞胚誘導(dǎo)效率并不高，因此前人探索了不同的處理方法，如熱激處理，改變培養(yǎng)基的pH及滲透壓，改變生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和濃度等[23-25]。相對(duì)于體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，器官發(fā)生途徑頻率高、周期短。一般植物器官發(fā)生途徑既可以先誘導(dǎo)愈傷組織，也可直接誘導(dǎo)不定芽，然后生根培養(yǎng)。南瓜屬作物通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽非常困難，目前還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，南瓜屬作物器官發(fā)生途徑均采用外植體直接誘導(dǎo)不定芽的方法。前人從外植體來(lái)源[26-27]、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類(lèi)和濃度[28-29]等方面做過(guò)不少探索，南瓜的胚軸、胚根和葉片很難誘導(dǎo)出不定芽[28，30]，子葉節(jié)（帶基部的子葉）因再生率較高而成為廣泛使用的外植體。趙建萍等[28]認(rèn)為子葉基部臨近下胚軸的切口處才能誘導(dǎo)出不定芽。Kathiravan等[31]以子葉節(jié)為外植體，對(duì)15個(gè)美洲南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，均獲得了再生，再生率為56%～94%，只有1個(gè)種質(zhì)為22%。Cheng等[32]也是利用子葉節(jié)誘導(dǎo)不定芽，成功獲得美洲南瓜雙單倍體再生植株。一些印度南瓜基因型也通過(guò)子葉節(jié)誘導(dǎo)不定芽獲得了再生植株，再生率較高[33-36]。Gisbert[37]對(duì)幾種南瓜屬作物種質(zhì)進(jìn)行離體再生，通過(guò)子葉節(jié)誘導(dǎo)再生芽，3種美洲南瓜、2種黑籽南瓜、1種印度南瓜和2種中國(guó)南瓜均獲得了再生植株。日本學(xué)者通過(guò)誘導(dǎo)子葉節(jié)在14份包括美洲南瓜、印度南瓜、黑籽南瓜和中國(guó)南瓜種質(zhì)中均獲得了再生苗，再生率為38%～76%[38]。不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中使用最多的是細(xì)胞分裂素，前人探索過(guò)不同激素的配比和濃度[36，39]，篩選出很多最優(yōu)組合。不定芽誘導(dǎo)成功后還要經(jīng)過(guò)芽伸長(zhǎng)、誘導(dǎo)生根和馴化移栽等過(guò)程。當(dāng)芽不易自然伸長(zhǎng)時(shí)，多添加赤霉素GA3誘導(dǎo)[39]。多數(shù)基因型在不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基上可正常生根[38]，添加生長(zhǎng)素類(lèi)激素可促進(jìn)生根。總體來(lái)說(shuō)，不定芽生根和組培苗馴化移栽比較容易。

綜合分析，高效穩(wěn)定的南瓜離體再生仍然存在一定困難，主要體現(xiàn)在體細(xì)胞胚再生困難且周期長(zhǎng)，愈傷組織幾乎不會(huì)再分化[36]，子房或胚珠培養(yǎng)再生率低。目前，以子葉節(jié)為外植體進(jìn)行離體再生是最成熟的方法，許多南瓜屬作物的不同基因型均獲得了較高的再生率，說(shuō)明以子葉節(jié)為外植體的器官直接再生途徑對(duì)南瓜屬作物具有普適性，該法成為南瓜遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。

2.2 南瓜基因型和外植體對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

不同南瓜基因型對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化有較大影響，可能是它們對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性不同。根據(jù)Nanasato[38]的研究結(jié)果，使用同一種農(nóng)桿菌菌株EHA105，不同基因型南瓜的轉(zhuǎn)化效率最低為0%，最高可達(dá)到9.2%。在外植體選擇方面，子葉節(jié)最為常用。前人在子葉節(jié)取材時(shí)間、子葉節(jié)的狀態(tài)等方面做了不少探索。白婧等[39]認(rèn)為印度南瓜‘金輝一號(hào)2片子葉直立、呈綠色時(shí)取材最佳，過(guò)早過(guò)晚均會(huì)降低轉(zhuǎn)化率。黑籽南瓜培養(yǎng)4 d的種子取子葉節(jié)最好[40]。張玉園[35]認(rèn)為印度南瓜‘北觀(guān)在子葉微展、呈黃綠色時(shí)為最佳的取材時(shí)間。日本學(xué)者Nanasato[41]對(duì)中國(guó)南瓜子葉節(jié)的取材時(shí)間為種子在28 ℃下萌發(fā)1 d、胚根剛長(zhǎng)出時(shí)。由此可見(jiàn)，子葉節(jié)的狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化成功與否至關(guān)重要。筆者分析可能的原因：一方面是子葉節(jié)近軸端芽的再生能力與其狀態(tài)密切相關(guān);另一方面是取子葉節(jié)時(shí)切割的傷口是農(nóng)桿菌侵染的入口，如果傷口距離有再生能力的細(xì)胞較遠(yuǎn)，則農(nóng)桿菌難以到達(dá)。子葉生長(zhǎng)時(shí)間不同，具有再生能力細(xì)胞的位置也有所變化，所以子葉的狀態(tài)很重要。除了子葉節(jié)，有文獻(xiàn)報(bào)道南瓜莖尖轉(zhuǎn)化成功的例子，Shah等[42]以莖尖為外植體進(jìn)行美洲南瓜遺傳轉(zhuǎn)化，成功獲得了轉(zhuǎn)nptII和cbf1基因的陽(yáng)性植株，轉(zhuǎn)化效率0.7%，這說(shuō)明莖尖也存在再生和被轉(zhuǎn)化的潛力。

2.3 農(nóng)桿菌對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌是生長(zhǎng)在土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，包括兩種主要類(lèi)型：根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes），分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒。在農(nóng)桿菌侵染植物的過(guò)程中，質(zhì)粒上的T-DNA區(qū)可整合于植物基因組而完成轉(zhuǎn)化[43]。很早以前，研究人員就證實(shí)了農(nóng)桿菌對(duì)南瓜的可侵染性和轉(zhuǎn)化的可能性，Katavi[c][']等[44]使用野生型8196和15834兩種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株嘗試轉(zhuǎn)化美洲南瓜，菌株8196可以使子葉誘導(dǎo)發(fā)根，經(jīng)過(guò)比較，誘導(dǎo)的根系和正常的南瓜根系在生理上存在很大不同。Toppi等[45]證明發(fā)根農(nóng)桿菌菌株、植株年齡和侵染時(shí)間均會(huì)影響美洲南瓜的轉(zhuǎn)化。在嘗試印度南瓜轉(zhuǎn)化時(shí)，F(xiàn)rancisco等[46]的研究結(jié)果表明，根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響不大。目前，得到廣泛應(yīng)用的農(nóng)桿菌工程菌株大多為根癌農(nóng)桿菌（如EHA101、EHA105、LBA4404、GV3301等）。前人研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株的侵染能力有所不同[47]，對(duì)離體再生也有影響[5]，因此選擇合適的菌株對(duì)南瓜遺傳轉(zhuǎn)化可能是個(gè)關(guān)鍵因素。

農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和活力對(duì)侵染效率有較大影響。一般-80 ℃保存的農(nóng)桿菌要進(jìn)行1～2次活化，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的活力最佳。不同于大腸桿菌（Escherichia coli），質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中的拷貝數(shù)不多，因此先挑取單菌落，再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)以保證質(zhì)粒的拷貝數(shù)。理論上菌液濃度越高、侵染時(shí)間越長(zhǎng)越有利于侵染，但濃度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起外植體受害過(guò)度而死亡。因此，要選擇合適的菌液濃度和侵染時(shí)間。在可參考的資料中，南瓜遺傳轉(zhuǎn)化菌液濃度OD600在0.1～0.8之間[35，39，41]，侵染時(shí)間5～40 min不等[35-36，41，48]。

Ti質(zhì)粒上的vir基因?qū)z傳轉(zhuǎn)化至關(guān)重要，其表達(dá)產(chǎn)物調(diào)控T-DNA的剪切、包裝、轉(zhuǎn)移和整合。因此，提高vir基因的表達(dá)有利于提高轉(zhuǎn)化效率。研究表明，溫度、pH值、糖類(lèi)、酚類(lèi)化合物都會(huì)影響vir基因表達(dá)[49-50]。一般農(nóng)桿菌的培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)基中添加蔗糖，pH為5.2，這個(gè)條件同樣適用于南瓜[41]。

農(nóng)桿菌具有趨化性，植物傷口處分泌的酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)引誘農(nóng)桿菌向傷口移動(dòng)。因此，添加酚類(lèi)物質(zhì)有利于侵染，其中乙酰丁香酮因效果好而最為常用，其濃度一般為200～500 μmol·L-1[35，41]，另外菌液中添加MES緩沖液可以使農(nóng)桿菌處在適宜的pH環(huán)境下。也有學(xué)者在侵染液中添加表面活性劑，如吐溫20、Silwet L-77等[14]，表面活性劑有利于農(nóng)桿菌在外植體表面附著，可能有利于轉(zhuǎn)化。

2.4 轉(zhuǎn)化方法的影響

轉(zhuǎn)化方法是遺傳轉(zhuǎn)化的核心，以提高農(nóng)桿菌與外植體侵染互作和高效的離體再生為原則。以南瓜子葉節(jié)為受體時(shí)，子葉節(jié)的切割方法不同，轉(zhuǎn)化效率也不同。子葉節(jié)的切割應(yīng)盡量使具有再生能力的細(xì)胞露于表面，以利于接觸農(nóng)桿菌。Nanasato[41]制備中國(guó)南瓜子葉節(jié)時(shí)經(jīng)過(guò)橫切和縱切，以保留子葉和下胚軸連接處的1/4子葉為外植體。張玉園[35]認(rèn)為，印度南瓜子葉節(jié)橫向和縱向均一切為二，轉(zhuǎn)化效率最高。侵染前的預(yù)培養(yǎng)有利于轉(zhuǎn)化，一般認(rèn)為，預(yù)培養(yǎng)過(guò)程中添加的細(xì)胞分裂素可促進(jìn)細(xì)胞分裂，代謝活躍，更有利于細(xì)胞接收外源基因。預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，印度南瓜子葉節(jié)預(yù)培養(yǎng)的最佳時(shí)間是36 h[39]，Nanasato[41]認(rèn)為中國(guó)南瓜子葉節(jié)經(jīng)過(guò)24 h預(yù)培養(yǎng)最好。侵染過(guò)程一般采用菌液浸泡法，考慮到農(nóng)桿菌侵染傷口的特點(diǎn)，不少學(xué)者通過(guò)造傷來(lái)增強(qiáng)侵染效果，造傷的方法包括超聲波處理[51]、玻璃微珠處理[52]、刀片切割[53]和硼酸鋁晶須處理[54-55]。另外，利用真空滲透處理可以減小農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞的阻力[38]。大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道造傷提高了轉(zhuǎn)化率，但造傷可能會(huì)影響外植體再生或降低外植體存活率。農(nóng)桿菌從侵染開(kāi)始到T-DNA整合完成需要大約2～3 d，這也是外植體和農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時(shí)間，24～25 ℃黑暗環(huán)境是常用的培養(yǎng)條件。共培養(yǎng)時(shí)，Nanasato等[41]采用浸濕液體培養(yǎng)基的3層濾紙代替?zhèn)鹘y(tǒng)的固體瓊脂培養(yǎng)基，在不影響轉(zhuǎn)化效率的同時(shí)降低了農(nóng)桿菌對(duì)外植體的傷害。T-DNA與基因組整合后，農(nóng)桿菌的脫除也很重要，一旦長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落將難以控制和脫除。一般先用脫菌劑浸泡，無(wú)菌水沖洗幾遍后涂抹干燥，在培養(yǎng)基中也需要添加脫菌劑，脫菌劑有頭孢霉素、羧芐青霉素以及新型抗生素美羅培南[41]。脫菌劑及其濃度的確定以抑菌效果好、對(duì)植物影響最小為原則。農(nóng)桿菌侵染和造傷處理都會(huì)傷害外植體，所以在某些植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，有學(xué)者在篩選前先進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。筆者認(rèn)為恢復(fù)培養(yǎng)可能也適用于南瓜，但恢復(fù)培養(yǎng)會(huì)增加假陽(yáng)性植株，增加后期篩選的工作量。陽(yáng)性植株的篩選方法取決于載體的抗性基因（如抗潮霉素、卡那霉素和除草劑基因）或報(bào)告基因（如GFP或GUS），前人采用適宜濃度的潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因黑籽南瓜[40]，利用GFP的熒光信號(hào)篩選中國(guó)南瓜陽(yáng)性植株等[41]。

3 基因槍法

基因槍法（Biolistic Bombardment）轉(zhuǎn)化植物的基本原理是高速發(fā)射包裹有重組DNA的金屬顆粒，使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞，進(jìn)而完成基因的整合和表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)化植株。基因槍法無(wú)宿主限制，受體可以是胚、愈傷組織和細(xì)胞懸浮液等，可控度高、操作簡(jiǎn)單。但該法獲得的轉(zhuǎn)基因后代容易出現(xiàn)突變、拷貝數(shù)多、容易發(fā)生基因沉默，還存在轉(zhuǎn)化機(jī)制不清楚、儀器昂貴等問(wèn)題。基因槍法應(yīng)用面不及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，在南瓜遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用也鮮有報(bào)道，李貞霞等[30]嘗試基因槍法轉(zhuǎn)化南瓜，以愈傷組織為受體，優(yōu)化了試驗(yàn)條件，獲得了表達(dá)GUS基因的愈傷組織，但并未獲得轉(zhuǎn)化植株。利用基因槍法進(jìn)行南瓜遺傳轉(zhuǎn)化可能需要更深入的探索。

植物遺傳轉(zhuǎn)化方法還包括真空滲入法、PEG法和電穿孔法等，這些方法在南瓜上的應(yīng)用未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

4 存在問(wèn)題與展望

高效穩(wěn)定的南瓜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)依然是個(gè)世界性難題，只有保證較高的轉(zhuǎn)化效率、保證較好的重現(xiàn)性才具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前，廣泛使用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法仍存在不少困難，主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：（1）缺乏穩(wěn)定高效的適宜轉(zhuǎn)化的再生體系。南瓜體細(xì)胞再生效率低，器官間接再生途徑愈傷組織誘導(dǎo)芽困難。目前，只有以子葉節(jié)為外植體的器官直接再生途徑可用，但這種途徑獲得的再生植株存在假陽(yáng)性、嵌合體、篩選困難等問(wèn)題，這些都是今后需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。筆者推測(cè)，選擇種子萌發(fā)早期（具有再生能力的細(xì)胞尚未分化）的子葉節(jié)可能有助于減少嵌合體和假陽(yáng)性。（2）遺傳轉(zhuǎn)化效率低。轉(zhuǎn)化過(guò)程受多種因素影響，如南瓜基因型、外植體狀態(tài)、農(nóng)桿菌菌株及其狀態(tài)、轉(zhuǎn)化方法等，其中的關(guān)鍵因素難以尋找，破解關(guān)鍵因素是提高轉(zhuǎn)化效率的根本。外植體前處理、預(yù)培養(yǎng)、侵染方法等與遺傳轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，也是今后應(yīng)重點(diǎn)解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

近年來(lái)，生物技術(shù)發(fā)展迅猛，很多園藝植物通過(guò)基因工程獲得了優(yōu)異的農(nóng)藝性狀。南瓜作為葫蘆科重要蔬菜作物，深受世界人民喜愛(ài)，但遺憾的是南瓜屬作物受重視程度不高，分子生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)不夠成熟。遺傳轉(zhuǎn)化不僅可應(yīng)用于遺傳改良，而且還是基因功能鑒定的有效途徑。在南瓜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)難以突破的情況下，有學(xué)者采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化驗(yàn)證基因功能。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化不依賴(lài)組織培養(yǎng)，簡(jiǎn)單快捷，如Francisco等[46]開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)便的印度南瓜瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的方法。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在南瓜上的應(yīng)用將極大地促進(jìn)南瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，從1995年至今，僅有兩篇文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得了轉(zhuǎn)基因抗病毒美洲南瓜[56-57]。南瓜遺傳轉(zhuǎn)化的應(yīng)用任重道遠(yuǎn)，這需要更多的資金投入，更需要堅(jiān)持不懈的努力。

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