西瓜枯萎病抗性鑒定技術方案

閆聞 王喜慶 賈云鶴 付永凱 尤海波

摘? ? 要： 西瓜是我國重要的葫蘆科經濟作物，西瓜枯萎病是真菌性土傳病害，在西瓜整個生長期均可發生，已嚴重影響到我國西瓜產業的可持續發展。筆者根據已有研究成果，對西瓜枯萎病的危害癥狀、病原菌分離鑒定及培養、人工接種鑒定技術、自然病圃鑒定等作了描述和規定，形成了適宜于西瓜枯萎病抗性鑒定的技術方案。

關鍵詞： 西瓜;枯萎病;人工接種;自然病圃;鑒定標準;技術方案

中圖分類號：S651? 文獻標志碼：B? 文章編號：1673-2871（2020）01-076-03

西瓜是一種重要的葫蘆科園藝作物，每年全球西瓜種植面積約350萬hm2，總產量約 10 000萬t[1]。我國是最大的西瓜生產和消費國，每年西瓜的種植面積約180萬hm2，總產量約 7 000 萬t（http：//faostat.fao.org）。西瓜在我國農業結構調整和農民增收中發揮著重要的作用。

西瓜枯萎病是由西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）侵染引起的一種在世界范圍內廣泛發生的真菌土傳病害[2]，主要通過土壤傳播，也可由種子傳播，嚴重危害西瓜生產，導致西瓜產量嚴重下降甚至絕產[3]。目前，西瓜枯萎病菌有4個生理小種：生理小種0，1，2和3，不同的生理小種可通過特定的鑒別寄主鑒定[4]。抗病品種選育是防治枯萎病危害的經濟有效的途徑。基于此，筆者根據西瓜枯萎病的生物學特征，結合已有的研究基礎制定了西瓜枯萎病抗性鑒定技術方案，該方案經多次應用驗證，適合于西瓜枯萎病的抗性鑒定，為抗病種質的篩選提供可靠的參考依據。

1 西瓜枯萎病病害癥狀

西瓜枯萎病在全生育期均可發病，在幼苗期發病較少，幼苗出土后，主要表現為莖基部變褐縊縮，子葉萎蔫下垂，幼苗猝倒，而后干枯死亡。多數病株從伸蔓期至果實膨大期發病，萎蔫枯萎是田間的典型癥狀，病株葉片自下而上逐漸萎蔫，似缺水狀，病情發展緩慢時，植株午間萎蔫，晚上逐漸恢復，幾次反復后病株不再恢復常態，萎蔫枯死，葉片不脫落，病情發展迅速時，葉片和莖蔓可突然由下而上全部萎蔫。病株的根部變褐腐爛，容易拔起，莖基部常縱裂，裂口處有褐色膠狀物，剖視病蔓基部，可見維管束變為褐色。在潮濕條件下，病部可產生白色或粉紅色霉狀物。在團棵期，部分病株表現為植株生長緩慢、苗小、蔓細和葉瘦小發黃，莖部維管束變褐，雨后常出現裂莖，植株為畸形的小老苗[5-6]。

2 西瓜枯萎病病原菌的分離與鑒定

2.1 病原菌分離純化

采用組織分離法分離病原菌[7]。在西瓜枯萎病發生地塊，采集西瓜病株莖基部組織，2～3 cm，流水沖洗，用 75%乙醇消毒 30 s，用無菌水清洗 3～5 次，去除莖表皮，切成1～2 mm薄片，輕輕按壓貼于 PDA 培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉 15 g、蒸餾水 1 L）表面，25 ℃，恒溫條件下培養 3～5 d，長出真菌菌落后挑取邊緣菌絲再進一步純化。若無其它雜菌，擴繁后則可制備孢子懸浮液。

西瓜枯萎病菌孢子懸浮液制備方法：在固體培養基上挑取 1個 0.5 cm2 菌片放入200 mL PL培養基（配方為：1 000 mL 水，馬鈴薯 200 g，乳糖 20 g）中，于搖床中 25 ℃、110 r·min-1 培養 5～7 d，將菌液用滅菌的4層紗布過濾，用血球計數板記數并調整孢子濃度為5×106個·mL-1。

2.2 病原菌鑒定

形態學特征：病原菌在 PDA 培養基上呈白色菌絲、隨著生長中間呈粉紅色、淡紅色、淡紫色、紫紅色等，菌落圓形，菌絲絨毛狀（圖1-A）。大型分生孢子為鐮刀型，有 3～5個分隔，以3個分隔為主（圖1-B）[10];小型分生孢子，橢圓形，0～1個分隔，以無隔為主（圖1-C）;分生孢子梗短、生于菌絲側面，單生，無分枝;厚垣孢子頂生或間生，圓形，多為單獨生長，偶爾也對生或串生[8-10]。

分子生物學鑒定：將病原菌接種于PL液體培養基，在25 ℃、110 r·min-1條件下振蕩培養3～4 d，過濾收集菌絲體，按照真菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌DNA，用真菌通用引物ITS1/ITS4（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCT

CCGCTTATTGATATGC）對病原菌 rDNA 的 ITS 區域進行 PCR 擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收、測序，將該序列提交至 GenBank，通過 BLAST進行序列比對，分析待檢菌株與Fusarium oxysporum同源性[10]。

病原菌回接試驗：確保分離的菌是西瓜枯萎病病原菌，完成柯赫氏法則。

生理小種鑒定：西瓜枯萎病菌生理小種鑒定采用Sugar Baby（或 Black Diamond），Charleston Gray，Calhoun Gray 和 PI296341-FR 作為一套鑒別寄主，生理小種劃分標準見表 1[4]，接種鑒定技術詳見枯萎病苗期人工接種鑒定：

3 西瓜枯萎病苗期人工接種鑒定

3.1 接種方法

3.1.1 壯苗培養 西瓜種子消毒催芽，1.5 %次氯酸鈉溶液消毒20 min，中間翻動1次，消毒結束后用流水沖洗干凈，浸種12 h，用濕毛巾包好在30 ℃恒溫箱中催芽，當80%以上的種子出芽時播種。在育苗盤中裝入滅菌的蛭石，澆透水，播種后用蛭石覆蓋，并蓋薄膜保溫保濕。出苗后白天溫度控制在24～28 ℃，夜溫在18 ℃度左右，防止徒長。

3.1.2 采用浸根法接種 孢子液浸根法接種，植株發病迅速、均勻，可縮短西瓜枯萎病的病程 [11-12] 。菌液的孢子濃度為5×106個·mL-1，待鑒定的不同西瓜種質幼苗以 25～30 株幼苗為 1 組，重復 3 次，接種前按苗數準備營養缽，裝入高溫滅菌的草炭土。播種后8～10 d，2片子葉平展時接種，接種在遮陰條件下進行，選取長勢一致的幼苗從蛭石中取出，根系輕度損傷，洗凈根部，在準備好的孢子液中浸根15 min，保持根系全部浸入，中間搖動2～3次，防止孢子沉降。浸根接種后，幼苗移栽至營養缽中。

3.1.3 接種后的植株培養 接種后前3 d保持遮陰，溫度保持在24～30 ℃，3 d緩苗后撤掉遮陽網，剔除不正常的苗子，自然光照條件下培養。

3.2 鑒定標準

感病寄主在接種后5～10 d發病，記錄寄主的生長和發病狀況，接種后15～21 d，調查病情指數，植株被定為0～5級，接種后癥狀見圖2[13]： 0級，無癥狀;1級，晴天中午子葉萎蔫或部分子葉、真葉輕微萎蔫;2級， 1片真葉萎蔫或子葉較重萎蔫;3級，子葉及真葉萎蔫，阻礙發育;4級，整株萎蔫，60%以上枯死，心葉成活;5級，整株嚴重萎蔫并枯死[13]。

抗性分級，以病株率進行評價：病株率≤20%為高抗：病株率21%～50%為中抗;病株率51%～80%為輕抗;病株率>80%為感病 [4] 。

病情指數=（∑（各級株數×發病級數）/總株數）×最高病級×100。

病株率/%=發病植株之和（株）/調查總株數（株）×100。

4 西瓜枯萎病自然病圃鑒定

自然病圃為西瓜連作地，土壤中西瓜枯萎病菌數量在1×104～1×105 cfu·g-1。待鑒定西瓜種質常規方法育苗，2葉1心定植于病圃大棚內，10株1組，設3 次重復，植株伸蔓后開始進行發病率統計，直至收瓜后結束調查。調查時，按照0～3級病情分級標準，逐株記錄發病情況，其中0級：健株，長勢良好無病癥;l 級：病株葉片自下而上逐漸萎蔫，似缺水狀，中午更為明顯，早晚尚能恢復;2級：病株葉片萎蔫，不能再恢復正常;3級：整株葉片呈發黃枯萎下垂，不能再恢復正常，葉片枯黃至全株死亡。病情指數和發病率計算公式、抗性分級標準同3.2。

5 小 結

苗期人工接種結合自然病圃鑒定結果，可全面的分析待鑒定西瓜種質對枯萎病的抗性情況，有助于枯萎病抗性種質資源的篩選和新品種抗病性評價。

本文所述技術方案對西瓜枯萎病的病害癥狀和病原菌的鑒定方法進行了詳細描述，同時對苗期接種和自然病圃鑒定方法及抗病鑒定指標進行系統性規范。該技術方案的制定，將為枯萎病抗性種質資源的篩選和新品種抗病性評價提供技術指導。

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