“樂(lè)胃飲”加味方對(duì)慢性萎縮性胃炎模型鼠胃黏膜病變及相關(guān)炎癥因子的作用*

徐燕立 朱飛葉 徐 珊

1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310003

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

慢性萎縮性胃炎（CAG）是以胃黏膜腺體萎縮為主要表現(xiàn)的臨床常見(jiàn)消化系統(tǒng)疾病，常伴有胃黏膜的腸上皮化生和異型增生，屬于胃癌的癌前疾病。持續(xù)存在的慢性炎癥對(duì)胃癌的形成發(fā)揮著重要作用，炎癥細(xì)胞因子白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可能是其中的核心炎癥介質(zhì)，這些因子釋放后在細(xì)胞表面形成一個(gè)炎癥微環(huán)境，使機(jī)體正常細(xì)胞的抑癌基因或原癌基因由基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞癌變[1]。我們前期的臨床研究表明，以健脾疏肝中藥為主的“樂(lè)胃飲”加味方治療CAG取得了很好的效果，不僅能改善癥狀，還能逆轉(zhuǎn)萎縮、腸化等病理變化[2]。本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)建立CAG大鼠模型，觀察“樂(lè)胃飲”加味方在治療CAG過(guò)程中對(duì)胃黏膜病變和炎癥因子表達(dá)的影響，以期探討出“樂(lè)胃飲”加味方對(duì)CAG的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，4周齡，體重180～200g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。

1.2 藥物與試劑：“樂(lè)胃飲”加味方由薏苡仁、懷山藥各30g，炒白術(shù)、炒白芍、郁金、香茶菜各15g組成，購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二門診部。按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，成人以體重60kg計(jì)算，大鼠體重以200g計(jì)算，“樂(lè)胃飲”加味方為120g/人·日，則人鼠等效劑量為12.6g/kg·日，按常規(guī)制成中藥水煎劑，濃縮成生藥含量為1.26g/ml的藥液，4℃冰箱內(nèi)保存。1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（MNNG）購(gòu)于日本TCI公司；水楊酸鈉購(gòu)于上海西隴生化科技有限公司；ELISA試劑盒（大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α）購(gòu)于北京四正柏生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物模型制備：1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（MNNG）用蒸餾水配成濃度為1g/L的存儲(chǔ)液，避光冷藏保存，使用時(shí)配成濃度為100mg/L，作為大鼠自由飲水，每天更換。同時(shí)予2%的水楊酸鈉溶液，每周一、周四對(duì)大鼠各進(jìn)行1次灌胃，2ml/只，灌胃前后各予禁食禁水1h。按第5周起單日予禁食，雙日予足量喂食的原則，模擬饑飽失常的狀態(tài)，連續(xù)造模。

1.4 分組與給藥：56只SPF級(jí)的雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥預(yù)防組、中藥分階段干預(yù)A組、中藥分階段干預(yù)B組、中藥分階段干預(yù)C組、中藥分階段干預(yù)D組，每組8只。其中預(yù)防組大鼠從造模開(kāi)始即給予“樂(lè)胃飲”加味方干預(yù)治療，分階段干預(yù)A、B、C、D組大鼠分別在造模第8、12、16、24周開(kāi)始給予“樂(lè)胃飲”加味方干預(yù)治療，正常組和模型組大鼠給予等量的生理鹽水干預(yù)。各組大鼠每日予灌胃1次，干預(yù)至32周結(jié)束。

1.5 胃黏膜病理組織學(xué)檢測(cè)：大鼠麻醉剖腹后沿胃大彎側(cè)剖開(kāi)，肉眼初步觀察胃黏膜病變，立即用冰生理鹽水沖洗后選取部分胃竇組織，用10%的中性甲醛溶液固定，按常規(guī)進(jìn)行脫水，石蠟包埋，組織切片和HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠胃竇的一般組織學(xué)表現(xiàn)。

1.6 ELISA法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IL1-β、IL-6、TNF-α的含量：大鼠麻醉后剖腹，予腹主動(dòng)脈取血，5mL/只，靜置離心取上清液，-80℃冰箱保存。在96孔板內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本100μl/孔，37℃孵育90min，洗板4次；加入生物素化抗體工作液100μl/孔，37℃孵箱孵育60min，洗板4次，加入酶結(jié)合工作液（100μl/孔），37℃孵育30min，洗板4次；加入顯色劑100μl/孔，避光37℃孵育10～20min；加入終止液100μl/孔，混勻后測(cè)量OD450值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的胃黏膜病理組織學(xué)表現(xiàn)：如圖1所示，正常組大鼠胃黏膜較為完整，腺體排列整齊；模型組大鼠部分胃黏膜層萎縮變薄，腺體變小，排列紊亂、疏松或者脫落，部分腺體腺腔擴(kuò)張，黏膜肌層增厚，向黏膜固有層伸展，間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)腸上皮化生。中藥預(yù)防組、分階段干預(yù)A組和分階段干預(yù)B組大鼠胃黏膜病變程度較模型組明顯減輕，分階段干預(yù)C組和分階段干預(yù)D組大鼠胃黏膜病變程度與模型組較為接近。

2.2 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)變化：見(jiàn)表1。

圖1 第32周各組大鼠胃黏膜病理（×100）

表1 第32周各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的含量（±s，pg/ml）

表1 第32周各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的含量（±s，pg/ml）

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

TNF-α 44.08±7.35 66.08± 7.13△44.75±6.26**47.25±11.65**51.75±14.11*54.75±3.17 56.08±10.25組別正常組模型組中藥預(yù)防組分階段干預(yù)A組分階段干預(yù)B組分階段干預(yù)C組分階段干預(yù)D組例數(shù)8 8 8 8 8 8 8 IL-1β 254.67±60.12 531.33±66.78△244.33±65.90**259.67±78.52**266.33±65.46**294.67±30.47**307.67±37.78**IL-6 661.75±27.52 845.50±86.44△653.75±53.09**664.25±46.96**679.25±18.92**689.00±74.10**723.75±73.34**

3 討論

中醫(yī)藥治療CAG具有一定優(yōu)勢(shì)，不僅能顯著改善癥狀，還對(duì)部分患者的腸上皮化生及異型增生有逆轉(zhuǎn)作用[3]。CAG多因久病常虛實(shí)相兼，表現(xiàn)為以脾胃虛弱為本，濕熱邪毒、氣滯血瘀為標(biāo)的病機(jī)特點(diǎn)。課題組根據(jù)長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐總結(jié)歸納出以健脾疏肝中藥為主的“樂(lè)胃飲”加味方，全方由薏苡仁、懷山藥、炒白術(shù)、炒白芍、郁金和香茶菜組成。其中薏苡仁為君藥，健脾滲濕；懷山藥、炒白術(shù)為臣藥，益氣健脾；炒白芍、郁金為佐藥，疏肝行氣、柔肝止痛；香茶菜為使藥，散瘀清熱解毒。諸藥合用以發(fā)揮健脾疏肝的功效。

本實(shí)驗(yàn)研究中我們觀察到模型組大鼠的胃黏膜層有萎縮變薄，腺體變小，排列紊亂、疏松或者脫落，還可以見(jiàn)到腸上皮化生的表現(xiàn)；而中藥預(yù)防組、分階段干預(yù)A組和B組大鼠的胃黏膜病變程度與模型組相比均有不同程度的減輕，且中藥干預(yù)的時(shí)間越早，胃黏膜病理得到改善的效果越明顯；干預(yù)時(shí)間較晚的分階段干預(yù)C組和D組大鼠胃黏膜病變程度有緩解，但總體情況與模型組較為接近；說(shuō)明“樂(lè)胃飲”加味方可有效治療CAG，延緩CAG的進(jìn)展，其療效與干預(yù)時(shí)間早晚相關(guān)。

在炎癥細(xì)胞因子表達(dá)方面，模型組大鼠血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)含量均明顯高于正常組大鼠的表達(dá)；經(jīng)過(guò)中藥干預(yù)治療，預(yù)防組、分階段干預(yù)各組大鼠血清中IL-1β和IL-6的表達(dá)含量對(duì)比模型組大鼠均可見(jiàn)顯著降低；預(yù)防組、分階段干預(yù)A組和B組大鼠血清中TNF-α的表達(dá)含量較模型組大鼠亦可見(jiàn)明顯下降；而且中藥干預(yù)的時(shí)間越早，上述細(xì)胞因子的表達(dá)水平越低；說(shuō)明“樂(lè)胃飲”加味方干預(yù)后可有效降低CAG時(shí)期細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。

綜上，“樂(lè)胃飲”加味方治療CAG具有保護(hù)胃黏膜、改善炎癥反應(yīng)以達(dá)到延緩疾病進(jìn)展的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平有關(guān)。