“長期負性情緒積累肝失疏泄加速腦老化進程”假說的思考和探索＊

秦中朋，詹向紅

（河南中醫藥大學認知神經科學實驗室 鄭州 450046）

“夫百病之始生也，皆生于……，陰陽喜怒，……大驚卒恐。”《內經》中如此論述不良情緒對于疾病的影響，而近年來隨著人口老齡化程度的持續加劇、社會競爭的日趨激烈和生物-心理-社會醫學模式的認可實踐，由長期負性情緒積累引發的疾病愈發多見且已被證實是腦老化相關疾病如輕度認知功能障礙（Mild cognitive impairment，MCI）、癡呆等的危險因素[1，2]。癡呆病死率高，危害嚴重，一旦罹患對大腦造成的神經元損傷不可逆轉[3]，給家庭和社會造成沉重的負擔[4，5]，并且當前藥物研究的局面不甚樂觀[6]。而緩衰益智是中醫學的優勢領域，一般認為，癡呆等腦老化疾病主要病位在腦，與五臟六腑功能失調[7]和痰濁血瘀阻塞腦竅[8]進而引起的精氣血津液運行輸布有礙、不能上充于腦關系密切，然而精氣血津液的運行輸布和五臟功能的正常發揮均有賴于全身氣機的通調暢達，肝主疏泄、調暢全身氣機是中醫學的特色命題，因此肝失疏泄對腦老化相關疾病的影響亦不容忽視。但是肝失疏泄如何影響腦老化相關進程，其現代醫學機制又是怎樣呢？當前文獻卻少有報道，因此課題組進行了如下的思考和探索。

1 確定科學假說

現代醫學研究發現，長期負性情緒積累人群易處于慢性情緒應激狀態[9]，經久不調容易造成下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamic pituitary adrenal，HPA）軸[10]的過度激活，繼而引起糖皮質激素水平的持續升高，而作為學習記憶關鍵部位的海馬，富含糖皮質激素受體，對應激反應更加敏感，極易受到損害[11]，導致學習記憶能力下降繼發癡呆等。中醫學中亦有“情志失調影響腦老化進程”相關記載：如《景岳全書》曰：“癡呆癥……，或以郁結，或以不遂，或以思慮，或以驚恐而漸癡呆”；《辯證錄·呆病門》論述：“大約起始也，起于肝氣之郁”，明確指出肝氣郁結肝失疏泄可能是腦老化加速并導致癡呆的始動因素。現代中醫學者對此亦有認識：陳立典團隊[12]通過調查統計發現肝病位證素占到了福州市老年MCI 人群中醫證素的第一位；龔華強等[13]通過對認知障礙門診中的MCI患者進行中醫證候調查，發現肝氣郁結證候占據所有MCI 患者中醫證候的首位，占比達到38.50%；于梅等[14]通過對157例老年期癡呆病人進行中醫辨證分型調查發現：具有肝氣郁證候的癡呆病例占比達39.49%；田金洲團隊[15]等通過文獻研究MCI 證候要素分布，發現肝病在中醫病位證候中占到14.17%。一般認為，情志是中醫學對于情緒的特有稱謂，其不僅是個體接受外界刺激后產生的主觀反映，同時也是五臟六腑的功能活動以及精氣血津液充盛與否的內在表現。若長期情志失常，經久不調，勢必導致肝失疏泄，氣機失常，氣血逆亂，精氣血津液運行輸布有礙，或氣血虧虛，腦失濡養；或痰瘀互結，清竅阻塞，化毒為害；或二者并見，虛實夾雜繼而傷及臟腑，擾亂神志，導致神機失靈，引發認知功能障礙而腦老化加速。

因此綜合以上研究分析，結合對現代醫學、中醫學研究現狀的總結和討論，課題組提出了“長期負性情緒積累肝失疏泄加速腦老化進程”的科學假說，認為曠日持久的情志失常，經久不調會導致肝失疏泄，影響全身氣機的正常運轉，進而影響五臟精華之血和六腑清陽之氣的輸布匯聚，最終導致腦之神機失用，加速腦老化等相關進程。課題組依托國家自然科學基金和國家重點基礎研發計劃的系列資助，進行了該假說的一系列探索和實驗，在一定程度上驗證了“長期負性情緒積累肝失疏泄加速腦老化”的部分機制，并探索創新了一些比較成熟的研究技術和方法。

2 創新實驗方法

近年來，課題組在“肝失疏泄加速腦老化”這一科學假說指導下，探索并創新間接電擊激怒法的單一長期憤怒誘發模型和復合長期負性情緒應激動物大鼠模型、首創正常人群憤怒情志誘發試驗材料的影片片段、探索并完善被試者的一般情況記錄表及認知功能篩查方案、制作并完善多個事件相關電位技術（Eventrelated potentials，ERPs）研究范式等。

2.1 創新“單一”長期憤怒情緒、復合負性情緒應激大鼠動物模型和正常人群憤怒情緒誘發材料

一般認為，動物實驗是從宏觀到微觀層次深入認識疾病發生發展機制的重要媒介。因此在探索長期憤怒情志影響腦老化進程的研究中，課題組首先從動物實驗開始，基于常見憤怒情緒造模方法如直接電擊法所誘發的情緒較為多樣復雜、兼有一定的恐懼情緒特征和憤怒情緒擊中率不高；間接夾尾刺激法對攻擊鼠易造成尾部皮膚損傷且進行夾尾操作時攻擊鼠往往出現不攻擊應激鼠反而回頭撕咬止血鉗的情況；居住入侵法等所誘發的憤怒情緒程度輕和時間短不能滿足長期憤怒情緒的要求（表1）。因此受直接電擊法和間接夾尾刺激法啟發[16，17]，課題組改良了間接電擊激怒法的長期憤怒情緒大鼠動物模型[18，19]：實驗過程中使用電極末端電擊刺激攻擊鼠胸腹部，攻擊鼠受電擊刺激后被激惹，不久即對其前方實驗組大鼠發起攻擊，雙方互相對峙、打斗、撕咬，繼而產生憤怒心理。使用間接電擊法每天刺激攻擊鼠15 min，刺激頻率為1-2 次/min，連續干預4 周后結果顯示：實驗組大鼠鼠毛豎立、怒目而視、佯攻尖叫、威嚇對峙，甚至撕咬、攀壓、打斗等，表情行為較好符合憤怒應激狀態特征[20]。該造模方法誘發憤怒情緒較為單純、應激持續時間長、軀體應激刺激少，較為適合“單一”長期憤怒情緒大鼠動物模型的制備。此外需要說明的是：以上造模方法所誘發的憤怒情緒仍然是混合情緒，并非嚴格意義的單一長期憤怒情緒，但相比較于當前文獻其他憤怒情志造模方法，該法誘發憤怒情緒的擊中率和持續時間更長，更加接近于單一長期憤怒情緒的研究目的。

表1 常見憤怒情志應激大鼠動物模型的特點

表2 常見長期負性情緒應激（抑郁）大鼠動物模型的特點

在間接電擊法制備單一憤怒情緒大鼠模型基礎上，課題組繼而改良并優化了多情交織作用下的復合長期負性情緒應激大鼠動物模型[21]。鑒于常見慢性負性情緒應激造模方法如慢性束縛法造模時間長且可能對動物本身產生軀體應激[22，23]、空瓶應激法所誘發的情緒重復性低、居住入侵（社交失敗）法造模成功率低[23]等缺點，而慢性輕度不可預知性心理應激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）造模方法可通過給予大鼠溫和、隨機和長期不同的應激因子而較好誘發和模擬人類的慢性長期抑郁狀態[24]（表2）。因此課題組選用改進的CUMS誘導方法[25-27]，并創新將其中易產生軀體應激的直接電擊和禁食禁水等刺激分別替代為慢性不可預知性心理應激因子間接電擊和懲罰性飲水[28]、將每種心理應激刺激時間稍微延長以更好誘發抑郁情緒并最大程度減少可能引起的焦慮因子[29]，最終將CUMS模型綜合改進為下述8種不同的心理應激因子，實驗過程中每天隨機序貫對應激組大鼠施以其中的一種[30，31]：①束縛：使用束縛筒束縛大鼠6 h·天-1；②溫水游泳：15 min·天-1；③間接電擊刺激攻擊鼠：15 min·天-1，頻率為1-2 次·min-1；④強光刺激：5 h·天-1，照明頻率為300 閃光·min-1；⑤搖晃：設置振蕩器30 min，頻率160 次·min-1；⑥潮濕墊料：12 h；⑦噪聲：3 h·天-1，強度為 90 dB；⑧懲罰性飲水：10 min·天-1等，持續造模4 周后結果發現：應激組大鼠目光無神，毛發零亂，攝水攝食量明顯減少，頭部蜷縮在身體中，夜間不時發出細聲尖叫，以上表情行為較好符合長期負性情緒抑郁狀態。此方法充分借鑒了上述間接電擊法的造模優勢，合理控制了軀體刺激成分，并將心理應激因子隨機序貫干預且使單一應激因子的作用時間稍微延長，較為適用于制備長期負性情緒應激抑郁大鼠模型。

鑒于動物實驗研究成果無法直接推及正常人群，課題組繼而創新制備了正常人群憤怒情緒誘發材料[32]：基于使用圖片、音樂或氣味等誘發的靶情緒強度和生態效度不理想，而影片采用視聽雙通道高強度誘發靶情緒且具有較高的生態學效度。因此課題組成員充分參考國內外情緒研究者使用的影片材料，經過大量走訪、調查并聽取多方權威專家、電影制片人和導演推薦，初步剪輯合成4部憤怒情緒誘發影片片段，經過倫理委員會批準后隨機選取某高校161名學生自愿者隨機觀看以上影片，以情緒誘發強度、擊中率、差異顯著性等作為靶情緒誘發強度評定指標，并經二次優化改良后刪掉以上合成影片中令人厭惡的鏡頭和其它血淋淋的場面，最終再次選取75名自愿者觀看后發現：制作合成的《罪惡和審判》影片片段誘發憤怒情緒最佳[33]。

2.2 探索并制作認知功能的流行病學調查軟件及一般情況記錄表等篩查方案

當前對于腦老化相關疾病如MCI、癡呆等重要的診斷方法仍是量表檢測，課題組通過查閱大量文獻和開展系列預試驗后發現：聯合使用蒙特利爾評估量表（Montreal Cognitive Assessment, MoCA）和簡易精神狀態量表（Mini-mental state examination, MMSE）初篩MCI患者，并用日常生活活動能力量表、全面衰退量表以及自編一般情況調查表[34]（包括性別、年齡、職業、婚姻狀況、受教育年限、家庭經濟情況、家庭居住地、是否患有或曾患有影響認知功能的疾病、是否服用藥物以及聽視覺障礙等信息）以再次確診MCI 患者的流行病學調查方案最佳[35]，并已將以上成果申報制作流行病學篩查軟件且經過多個國家自然科學基金試驗驗證以上方案有效可行。

2.3 制作、改良并完善工作記憶、前瞻記憶及執行功能事件相關電位實驗范式

近年來，ERPs以其高時間分辨率、低成本、客觀性強、對人體無創傷且便于反映認知的動態時間特征等優勢被譽為是觀察腦高級功能的窗口，因此課題組將ERPs探索引入研究“長期負性情緒積累肝失疏泄加速腦老化”的相關神經電生理機制中。鑒于腦老化等認知障礙性疾病多以記憶力下降為主，其中工作記憶[36]、前瞻記憶[37]及其相關的執行功能[38]是其重要的受損成分，課題組先后完善并改良了研究以上成分的ERPs范式：分別采用不同任務負荷的中文版數字廣度N-back 實驗范式以評估肝失疏泄型MCI 患者言語和空間工作記憶受損情況[39]；采用標準版紅黃綠3 種顏色和人物、動物、植物和日用品4 類常見的400 個漢語詞語組成的“色詞”前瞻記憶雙任務研究范式評估被試者前瞻記憶水平：進行中任務為每一次刺激呈現時，請被試者在規定時間內判斷屏幕中間出現的2個詞語是否屬于同類，如果相同，則按【J】鍵，如果不同，則按【F】鍵。前瞻記憶任務為：若屏幕中間顯示的2個詞語為隨機數確定的紅黃綠3 種特定顏色中的1 種，被試者則不用進行詞類判斷，只需按下空格鍵。通過預試驗研究結果顯示以上范式可較好誘發前瞻記憶P200、N300、PP 等特異性ERPs 成分；在此基礎上，我們又創新完善了執行功能3個相關范式評估被試者執行功能受損情況：分別是紅黃綠3 種顏色和紅黃綠3 個字組成的色詞stroop 抑制控制試驗范式、N-back 數字廣度記憶刷新試驗范式以及1-9（不包括5）共8 個數字和紅綠2種顏色組成并根據不同顏色分別判斷數字大小和奇偶的靈活轉換試驗范式，并經相關預試驗研究證實以上范式有效可行。

3 逐層開展探索

課題組從2006 年開始，經倫理委員會批準，先后在河南省鄭州市及其周邊城市、山東省濟南市及其周邊城市等多地進行了“肝失疏泄加速腦老化進程”3個層次的深入研究，逐層探索了單一長期負性情緒積累（憤怒情緒）對認知老化進程的影響、多情交織作用下的長期負性情緒積累（復合情緒）對認知老化進程的影響、疏肝解郁方藥對認知老化進程的影響及機制研究，其具體步驟和成果簡述如下：

3.1 單一負性情緒積累（憤怒情志）對認知老化進程的影響

中醫學對“怒傷肝”理論頗有認識，如《內經》有云：“肝在志為怒，怒傷肝，悲勝怒”，另有“大怒則形氣絕，而血菀于上，使人薄厥”等論述。怒作為負性情緒的重要組成部分，當前社會環境下其對個體身心健康和認知老化進程如癡呆等影響愈發突出[40]。因此，課題組首先從單一長期負性情緒積累憤怒情緒入手，以動物、阿爾茨海默病（Alzheimer's disease, AD）患者和正常在校大學生為試驗對象，分別進行了憤怒情緒與認知功能減退的動物實驗研究、憤怒情緒積累與認知功能減退的回溯性病例對照研究、憤怒情緒對正常人群的工作記憶研究和個體差異ERPs 研究。在動物實驗研究中，課題組先后通過大鼠曠場實驗，大鼠的病理組織大腦皮層、海馬及神經元形態學和超微結構檢測，血漿氧化指標檢測，神經內分泌HPA 軸功能檢測等，證實長期憤怒情緒可顯著降低大鼠空間學習記憶能力，加重大鼠大腦海馬神經元退行性病變，HPA 軸過度激活，提示長期憤怒情志可明顯加速大鼠腦老化進程[18]；那么憤怒情緒對AD 患者的影響是怎樣的呢？課題組在動物實驗研究基礎上，對部分AD 患者進行了憤怒情緒積累與認知功能減退的回溯性病例對照研究[41]：發現其OR值（95%CI）為51.857（14.009,191.954），提示長期憤怒情緒積累是AD 發病的危險因素；那么憤怒情緒對正常人群的影響是否也是如此？為使動物實驗和臨床患者研究成果推及正常人群，課題組使用工作記憶行為學測試軟件對高低憤怒特質組正常大學生施以課題組制作的憤怒情志誘發影片[32]后發現：高憤怒被試者工作記憶容量下降，高特質怒喚醒狀態可改變神經內分泌功能；并在此基礎上，課題組進一步使用go/nogo 試驗范式對高低特質被試者進行ERPs 研究抑制控制能力后發現：與低特質怒個體相比，高特質怒個體nogo 刺激時平均腦電P300 波幅較小，提示高特質怒者抑制控制能力較低[42]。以上試驗分別證實長期憤怒情志可加速大鼠和AD 患者認知老化進程，影響正常人群認知功能。

然而，當前生物-心理-社會醫學模式下負性情緒應激往往呈現多情交織共同致病，如喬明琦課題組[43]通過對553 例情志病患者流行病學調查發現：兩種或兩種以上負性情緒多情交織共同致病者高達88.97%，周鶯等[44]、張慧等[45]分別通過研究古代和清代情志病證醫案，同樣發現多種情質因素共同致病最為常見。那么多情交織作用下的長期負性情緒積累對于認知老化進程的影響又是怎樣呢？

3.2 長期負性情緒積累對認知老化進程的影響

以長期負性情緒積累為自變量，課題組分別進行了動物實驗研究、正常人群的ERPs 研究和MCI 與正常人的病例對照研究。在動物實驗中，課題組采用上述優化和改良的長期負性情緒應激大鼠模型，分別進行了曠場實驗、大腦皮層形態學、血漿氧化指標、HPA軸指標、谷氨酸和Ca2＋濃度、海馬神經元NMDAR、CaM、CREB 檢測以及甲基化程度等檢測，結果顯示：相比較對照組，長期負性情緒應激組大鼠學習記憶能力下降，海馬CA1 區神經細胞數目明顯減少、排列松散、胞核染色變淺且伴有膠質細胞增生，HPA軸ACTH、CORT等激素含量明顯升高，大鼠海馬NMDAR 含量顯著增加[21]，NR2B 和 BDNF 基因啟動子區 CpG 甲基化程度顯著增高[31]，提示長期復合負性情緒積累可加速大鼠認知老化進程；在動物實驗研究基礎上，經倫理委員會批準，課題組篩選長期負性積累人群自愿者并對其進行了流體智力檢測，衰老生物學指標8-OHdG、SOD、LPO檢測，端粒長度、活性以及ERPs試驗，結果顯示長期負性情緒積累人群總體智力水平和反映速度有所下降[46]、衰老生物學以上3 個指標均高于對照組，端粒長度和端粒酶活性均低于對照組[47]，腦電試驗N1 波幅、PP 潛伏期延長，認知加工速度下降[48]，提示長期負性積累可加速正常人群腦老化進程；鑒于AD 病程的不可逆和目前不甚樂觀的藥物研究局面，課題組招募AD 前期的肝氣郁結型MCI 患者進行了病例對照研究，其OR 值（95%CI）為5.364（1.774, 16.225），提示長期負性情緒積累是MCI 的危險因素。以上研究結果證實長期負性情緒積累可加速動物、MCI 患者認知老化進程，影響正常人群認知功能。鑒于中醫學在未病先防、既病防變的緩衰益智方面具有獨特優勢，那么使用疏肝解郁的方法對長期負性情緒積累MCI 患者進行用藥干預，能否改善其認知功能，其神經機制又是什么呢？

3.3 疏肝解郁方藥對認知老化進程的影響及機制研究

肝主疏泄的調控部位在腦，而高空間分辨率的功能磁共振技術（Functional magnetic resonance imaging，fMRI）可較為立體而準確地定位腦功能和結構的損傷部位，因此我們將fMRI技術引入到研究疏肝法對認知老化進程的影響及機制中。

經河南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準（批號：2015HL-059），課題組選取長期負性情緒積累肝失疏泄MCI 患者的一種常見中醫證型—肝氣郁結證進行研究，使用上述認知功能篩查方案和肝氣郁結證癥狀程度計分表[49]（需要說明的是，課題組在使用肝郁量表評判被試者肝郁程度時，會向被試者強調說明該量表選項中的每個癥狀發生時間均要持續3個月以上，以盡可能保證被試者的肝郁癥狀是長期情志不暢而非一時之郁），綜合篩選46-65周歲的肝氣郁結型MCI 用藥組、肝氣郁結型MCI 未用藥組和正常對照組3組自愿者，使用疏肝解郁代表方藥逍遙丸（河南省宛西制藥股份有限公司，批號：140409）對肝氣郁結型MCI 用藥組自愿者進行連續3 個月用藥干預，并分別進行用藥前后3 個月的兩次工作記憶的ERPs 檢測、fMRI 的磁共振波譜、功能連接和局部一致性研究，以及衰老生物學指標檢測和韋氏成人記憶量表檢測等，結果發現肝氣郁結型用藥組MCI患者干預后MoCA 量表總分和所有認知域得分均有所增加[50]，磁共振波譜顯示用藥后右后扣帶回膽堿與肌酸的比值降低[51]，衰老生物學指標8-OHdG 含量降低，端粒酶活性升高[52]，Oddball任務中P300波幅已與正常無顯著差異，N-back任務下P300潛伏期延長，提示肝郁型MCI患者用藥干預3 個月后可逐漸恢復記憶模板；N400 潛伏期縮短、波幅降低，提示疏肝法可顯著改善MCI 患者認知功能，其機制可能與降低肝郁MCI 患者的氧化應激水平、降低海馬環路中后扣帶回區域膽堿化合物水平以及改善工作記憶的編碼、儲存能力等有關。

4 總結和展望

綜上所述，課題組圍繞“長期負性情緒積累肝失疏泄加速腦老化進程”的科學假說，依次從單一長期負性情緒（憤怒特質）研究拓展到多情交織作用的長期復合負性情緒積累，從動物實驗研究拓展到正常人群再到AD 和MCI 患者，從未用藥研究拓展到疏肝解郁方藥干預肝氣郁結型MCI 患者，并充分結合高時間分辨率的ERPs和高空間分辨率的fMRI等現代神經心理學技術，有效證實了長期負性情緒積累肝失疏泄可加速腦老化進程；并在一定程度上提示使用疏肝法可在改善肝郁型MCI 患者肝郁癥狀的同時，也可有效改善和提高其總體認知功能。

需要說明的是，新近有研究證實前瞻記憶[37]和執行功能[38]損傷也是認知功能衰退的早期敏感指標，并且兩成分損害呈現正相關[53]。此外，一般認為眼睛（目）是大腦思維活動和情緒變化的外在反映，同時也是大腦獲得外界信息的主要渠道，即察目可通于神，“肝開竅于目”、“目系通于腦”，且當前多項研究報道眼動技術可提供敏感的、非侵入性的認知（變化或惡化）的標記，是早期診斷MCI 及AD 的敏感工具[54]。因此，課題組下一步將從前瞻記憶和執行功能角度入手，聯合使用神經心理學ERPs、fMRI 和眼動技術等，對疏肝法改善肝郁型MCI 患者的神經心理學機制進行多維度深入研究，以期為MCI 的中醫臨床干預提供新思路，為中醫腦老化學說增添新內涵。