麻黃連翹赤小豆湯對5-HT所致瘙癢模型大鼠與不同細胞系中5-HT1A及GRPR表達的影響＊

肖珍妮，金 路，譚張奎，陶春暉

（湖北中醫藥大學中醫臨床學院 武漢 430061）

瘙癢通常被定義為一種能引起極強烈搔抓欲望的不悅反射[1]。與對溫、熱、痛的感覺類似，瘙癢也是機體正常生理狀態下的一種重要自我保護機制[2]。多項流行病學調查發現，13.5%的成人患有瘙癢癥，人群中一年內出現強烈搔抓行為的比率是16.4%[3]。瘙癢不僅見于多種常見皮膚疾患，不少系統性疾病均有皮膚瘙癢的臨床表現，嚴重影響患者的生活質量。目前抗組胺藥是臨床上治療瘙癢癥的首選藥物，但其對大部分瘙癢癥無明顯效果，且副作用較大，這可能與抗組胺藥只針對組胺獨立引發的瘙癢有關。慢性瘙癢癥患者非常容易陷入“瘙癢-搔抓-瘙癢”的惡性循環之中[4]，持續的瘙癢可能使患者出現皮膚破潰、感染等一系列表現，也可能導致患者焦躁，甚至表現出抑郁或自殺傾向[5]。有研究表明，脊髓背角（Spinal dorsal horn，SDH）神經節中表達的GRPR 可引起瘙癢，中樞性5-HT1a 受體與瘙癢的發生有關系[6，7]。另有研究證實，經5-HT1a 受體介導的胃泌素釋放肽（Gastrin releasing peptide，GRP）/胃泌素釋放肽受體信號通路是調控癢覺的重要信號通路之一[8]。麻黃連翹赤小豆湯最早見于《傷寒論》第262 條：“傷寒瘀熱在里，身必黃，麻黃連軺赤小豆湯主之。”原方用于治療陽黃兼表之證，以方測證，原文應有“身癢”的癥狀存在。全方組成為連軺（Radix Forsythia Suspensa）、生梓白皮（Cortex Catalpae）、赤小豆（Semen Phaseoli）、麻黃（Herba Ephedrae）、大 棗（Fructus Jujubae）、生 姜（Rhizoma Zingiberis Recens）、杏仁（Semen Armeniacae Amarum）、炙甘草（Radix Glycyrrhizae），連軺、生梓白皮現臨床已多不用，由連翹（Fructus Forsythiae）、桑白皮（Cortex Mori）代替[9-10]。多年臨床實踐表明，此方針對常見瘙癢癥狀的病理病機，在皮膚病的治療中針對屬于濕熱引起的瘙癢癥狀療效確切，禁忌癥不多，尚無明顯嚴重副作用的報道[11]。因此，本實驗以5-HT1a-GRPR 協同效應為切入點，建立5-HT誘導的大鼠瘙癢模型，旨在研究麻黃連翹赤小豆湯治療瘙癢癥的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體質量（160 ± 20）g，購自湖北省實驗動物研究中心。動物質量許可證號SCXK（鄂）2015-0018。大鼠采用標準飼養，動物房空調控溫，溫度（23± 2）℃，相對濕度60% ± 5%，日光燈控明12 h，明暗交替，大鼠自由攝食飲水。動物實驗獲得湖北中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準（倫理審查證號：HUCMS201909007），本實驗完全遵循國家實驗動物福利倫理的相關規定，符合動物保護、動物福利和倫理原則。

1.2 中藥制備

按照原書劑量1兩等于3 g進行折算，麻黃連翹赤小豆湯所有藥物飲片均購自湖北省中醫院，鑒定人陶春暉。用傳統煎藥方法，藥物浸泡0.5 h 后連續煎煮2次，低溫濃縮成低、中、高3種濃度，滅菌，4℃冰箱內貯存備用。根據《中藥藥理研究方法學》[12]，臨床等效劑量按人與大鼠體表面積比值計算得出，中藥濃度分別為4300 mg·kg-1、8600 mg·kg-1、17200 mg·kg-1。

1.3 實驗試劑

5-羥色胺鹽酸鹽（北京索萊寶科技有限公司，批號：419C021）；水合氯醛（國藥集團，批號：10009218）；磷酸酶抑制劑（碧云天生物技術，批號：S1873）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術，批號：P0010）；兔多抗 5HT1A（武漢博士德，批號：bs-1124R）；兔多抗GRPR（affinity，批號：DF7114)；兔多抗GAPDH（杭州賢至生物，批號：AB-P-R001）；HRP 標記羊抗兔二抗（武漢博士德，批號：BA1054）；二甲苯（國藥集團，批號：10023418）；蘇木素（Sigma，批號：H9627）；鹽酸（國藥集團，批號：10011018）。

1.4 實驗儀器

微量移液器（德國Eppendorf）；電泳儀電源（北京六一儀器廠）；垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；電轉儀（北京六一儀器廠）；水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；pH 計（德國Metter-Toledo GmbH 公司）；電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；磁力攪拌器（江蘇金壇市中大儀器廠）；酶標儀（美國Thermo）；高速低溫離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；qPCR（美國Applied Biosystems 7500）。

2 實驗方法

2.1 動物分組、造模及給藥

隨機將40只雄性SD 大鼠分為空白組，模型組，麻黃連翹赤小豆湯低、中、高3 個劑量組，每組8 只。參照文獻[13]，實驗前3 天將大鼠頸背部毛發剪去，模型組及藥物干預組大鼠于其頸背部皮內（肩腳連線中點上方 5 mm 處）注射 10 μ1 2%5-HT（94 mmol·L-1）溶液，空白組大鼠注射等量等體積生理鹽水，進針10 s，注射完畢后留針約5 s以防藥液外漏。造模完成后，分別以4300 mg·kg-1、8600 mg·kg-1、17200 mg·kg-1濃度的麻黃連翹赤小豆湯和等體積的生理鹽水灌胃治療14天。

2.2 動物標本采集及處理

藥物干預14 天后，用10%水合氯醛按0.33 mL·kg-1腹腔注射麻醉大鼠。待大鼠麻醉成功后，剃毛器剔除腰部皮毛，酒精棉球擦拭手術區，將其俯臥位固定于解剖板上，分離脊柱兩旁肌肉充分暴露，取出C3-C5段脊髓，將其置于凍存管中，放置-80℃凍存備用。

2.3 細胞培養

表達GRPR的人前列腺癌PC-3細胞與表達HTA1的 HKE-293 細胞購自 ATCC，PC-3 細胞于 RPMI-1640培養基中培養，培養基中添加10%胎牛血清、PEST（青霉素 100μg·mL-1、鏈霉素 100μg·mL-1）和 2μmM L-谷氨酰胺。HKE-293 細胞則在含有10%胎牛血清的高糖HyClone 培養基中培養。培養箱環境穩定在37℃和100%相對濕度，5%二氧化碳+95%空氣。胰蛋白酶EDTA（0.05%胰蛋白酶，0.02%EDTA 緩沖液；生物色素AG）用于細胞分離。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。當細胞密度達到90%以上時，接種于24孔板（每孔2×105個細胞）。

2.4 指標測定

2.4.1 行為學觀察

分別選取空白組和模型組中注射過程無明顯激惹的大鼠各3 只，放入與飼養環境基本相同的透明觀察籠內，在觀察籠的上方放置高清攝像機，同時記錄兩組大鼠的搔抓行為，記錄期間，保持室內安靜，實驗人員離開觀察室，1小時后關閉攝像機，結束拍攝。行為學觀察以大鼠的搔抓次數作為評判標準：以大鼠后爪觸碰搔抓身體任何區域的皮膚，到其爪離開或舔舐作為一個完整的搔抓動作，在此期間不管搔抓多久，均記為1次。

2.4.2 免疫蛋白印跡法測定SDH 中5-HT1a 和GRPR蛋白表達

用RIPA 裂解液提取脊髓中的蛋白，蛋白質含量測定采用BCA 法，隨后作SDS-PAGE 轉膜封閉，滴加抗5-HT1a，GRPR 一抗（1∶1000）孵育，滴加HRP 標記二抗（1∶50000）并孵育2 h。最后按說明流程顯現熒光帶，最終顯影液顯影、定影液定影，晾干，掃描，采用Band Scan 軟件分析獲取各組大鼠的蛋白條帶表達灰度值。

2.4.3 免疫組化法測定SDH 中5-HT1a 和GRPR 蛋白表達

用4%多聚甲醛固定脊髓，取石蠟切片脫蠟、脫水后浸泡到配制好的枸櫞酸緩沖液盒中進行微波修復；采用3%H2O2在室溫孵育15 min；用5%山羊血清封閉30 min；滴加 50μL 的 5-HT1a、GRPR 抗體（一抗稀釋濃度均為1：100），同時用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗設立陰性對照，將切片放入濕盒中，4℃過夜；滴加山羊抗兔二抗（1∶1000），室溫下放置30 min；滴加ABC工作液，37℃孵育20 min；DAB顯色；蘇木素復染；二甲苯透明封固。染色一脊髓基質表層和中層出現棕黃色顆粒為染色陽性。使用IPP6.0 軟件對免疫組化照片進行光密度分析。

2.4.4 實時熒光定量PCR 技術測定細胞中5-HT1a 和GRPR mRNA表達量

將傳代后PC-3 細胞與HKE-293 細胞分別分為，空白組、對照組與干預組，所有分組分3 個復孔進行。空白組不做處理，對照組加入20μL 培養基，加藥組加入 20μL 過濾后藥物（8.6 mg·mL-1），經24 h 后終止培養。隨后在細胞培養孔中加入800μL Trizol，隨后依次加入細胞裂解液氯仿、異丙醇與75%酒精提取總RNA。將RNA溶于加入DEPC（焦碳酸二乙酯）的去離子水隨后用紫外分光光度計測定A260及A280定量分析RNA 的純度和濃度。進而根據總RNA 濃度和反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，反應條件為：退火25℃，5 min；延伸42℃，60 min；失活70℃，5 min。檢測引物（表1）為。

表1 研究中所用熒光定量PCR引物

qPCR 反應體系包括 10 μL 的 SYBR Green Premix Ex Taq II，正反向引物 1.6μL（5 pmol·μL-1），4.8μL 的ddH2O 與 2μL 的 cDNA。反應條件為預變性 95℃，30 s，變性95℃，5 s，60℃，30 s，循環數40；溶解曲線：95℃，15 s，60℃，30 s，95℃，15 s。檢測以GAPDH 為內參，校正每個樣品的Ct值，得ΔCt值。

2.5 統計學分析

采用SPSS25.0 統計軟件處理，數據測定值以均數±標準差（）表示，符合正態分布和方差齊性時用單因素方差分析，兩組樣本均數間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05時認為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 對瘙癢模型大鼠癢覺的影響

與空白組比較，模型組在第1、7、14天搔抓次數顯著升高（P＜ 0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量組在第1 天差異無統計學意義，在第7、14 天搔抓次數顯著降低（P＜ 0.01）；高劑量組較低中劑量組更顯著（P＜0.05）（表2）。

3.2 麻黃連翹赤小豆湯對瘙癢模型大鼠SDH 中5-HT1a和GRPR表達的影響

3.2.1 免疫組化檢測結果

染色以棕黃色顆粒為陽性染色，空白組大鼠脊髓背角神經節胞漿5-HT1a和GRPR呈弱陽性表達，模型組大鼠脊髓背角神經節胞漿5-HT1a 和GRPR 呈陽性表達。麻黃連翹赤小豆湯低、中、高劑量組大鼠脊髓背角神經節胞漿5-HT1a和GRPR呈弱陽性表達。

表2 各組大鼠有效搔抓次數差異性比較（，n = 8）

表2 各組大鼠有效搔抓次數差異性比較（，n = 8）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，##P ＜ 0.01；與中劑量、低劑量組比較，△P ＜ 0.05

高劑量治療組71.67±4.51 52.00±3.00##△37.33±3.06##△組別/天數第1天第7天第14天空白組17.67±7.51 18.00±2.00 17.33±3.51模型組79.67±4.73**76.00±2.00**74.67±2.52**低劑量治療組71.00±3.00 67.67±1.15##65.33±2.30##中劑量治療組71.33±4.04 63.67±1.53##60.33±2.52##

表3 各組大鼠5-HT1a和GRPR蛋白免疫組織化學染色陽性表達平均光密度值的比較（，n = 3）

表3 各組大鼠5-HT1a和GRPR蛋白免疫組織化學染色陽性表達平均光密度值的比較（，n = 3）

注：與空白組比較**)P ＜0.01；與模型組比較##)P ＜0.01

--GRPR 0.01±0.01 0.10±0.02**)0.08±0.01**, ##)0.08±0.01**, ##)0.05±0.01**, ##)組別空白對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組劑量/(mg·kg-1)4300 8600 17200 5-HT1a 0.04±0.02 0.17±0.01**）0.09±0.11**, ##）0.09±0.08**,##）0.09±0.04##）

表4 各組大鼠5-HT1a和GRPR蛋白表達的比較（，n=3）

表4 各組大鼠5-HT1a和GRPR蛋白表達的比較（，n=3）

注：與空白組比較*)P ＜ 0.05，**)P ＜ 0.01；與模型組比較#)P ＜ 0.05，##)P ＜ 0.01

GRPR/GAPDH 0.24±0.01 0.57±0.05**)0.50±0.03**)0.40±0.01**, ##)0.35±0.04*, ##)組別空白對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組劑量/(mg·kg-1)--4300 8600 17200 5-HT1a/GAPDH 0.24±0.04 0.59±0.06**)0.52±0.06**)0.42±0.05**, #)0.36±0.04##)

圖1 各組大鼠SDH中5-HT1a的表達變化（免疫組化，400×）

與空白組比較，模型組大鼠SDH中5-HT1a、GRPR的平均光密度值顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組5-HT1a、GRPR 平均光密度值顯著減少（P＜0.01）（表3、圖1、圖2）。

3.2.2 免疫印跡檢測結果

與空白組比較，模型組大鼠SDH 中5-HT1a、GRPR 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃連翹赤小豆湯中、高劑量組5-HT1a、GRPR 蛋白表達顯著下降（P＜ 0.05，P＜ 0.01），而低劑量組SDH 中5-HT1a、GRPR蛋白表達無明顯差異（表4、圖3）。

3.3 對細胞中5-HT1a和GRPR表達的影響

結果顯示，在PC-3 細胞中，空白組與對照組GRPR mRNA 表達量無顯著性差異；然而，與對照組比較，麻黃連翹赤小豆湯處理組GRPR mRNA 表達量下降，差異具有統計學意義（P＜ 0.05）；在HKE-293細胞中，空白組與對照組5-HT1a mRNA 表達量同樣無顯著性差異；與對照組比較，麻黃連翹赤小豆湯處理組5-HT1a mRNA 表達卻下降，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖4、圖5）。

圖2 各組大鼠SDH中GRPR的表達變化（免疫組化，400×）

圖3 免疫印跡法檢測DRG中5-HT1a、GRPR蛋白表達

圖4 各組PC-3細胞中GRPR mRNA表達的比較

4 討論

圖5 各組HKE-293細胞中5-HT1a mRNA表達的比較

瘙癢癥通常被納于中醫學“風瘙癢”“癢風”等范疇，傳統中醫學認為，瘙癢常由內外二因所致，臟腑氣血失和為其內因，風、濕、熱、毒、蟲等為其外因，而濕熱乃是瘙癢的重要病機。麻黃連翹赤小豆湯初出自于東漢張仲景所著《傷寒雜病論》一書，方中取麻黃、杏仁、生姜宣散肺氣、解表散寒之效，共祛表邪，以連翹、赤小豆、桑白皮等祛濕除熱為臣藥，輔以甘草、大棗以調和藥性，再與生姜相伍，健脾和中，調其營衛。諸藥合用，使麻黃連翹赤小豆湯具有解表散邪、祛風止癢、清熱除濕之效。因此，臨床上可用其治療濕熱型皮膚瘙癢相關疾病。關于麻黃連翹赤小豆湯止癢的作用機理，在此之前已有一些研究，麻黃連翹赤小豆湯能夠對外源性組胺和右旋糖酐誘導釋放內源性組胺動物瘙癢模型起到明顯止癢作用，同時通過對方中麻黃的實驗研究表明麻黃堿對豚鼠局部疹癢及小鼠全身痛癢也有顯著的止癢作用[14]。本課題組前期研究發現麻黃連翹赤小豆湯能抑制肥大細胞脫顆粒，減少組胺釋放，從而保護肥大細胞，對抗Ⅰ型變態反應，直接或間接的止癢[15]，但是，因缺少明確癢覺產生-傳遞-效應通路研究對照，缺少對麻黃連翹赤小豆湯止癢機理的充分研究。本實驗以5-HT1a-GRPR 協同效應為切入點，發現麻黃連翹赤小豆湯對5-HT 誘導的瘙癢模型大鼠治療效果顯著。

5-HT 又被稱為血清素，廣泛存在于人類外周組織和血小板中，少數存在于其他動物的肥大細胞中，是中樞神經系統中重要的神經遞質之一[16]。5-HT 作為單胺類神經遞質，被認為在痛覺傳導中有著關鍵而復雜的作用，最近有研究證實，它在瘙癢的傳導中也起到了關鍵作用。高劑量的5-HT 可以引起人或鼠類的疼痛和瘙癢感，而低劑量的5-HT 只能引起瘙癢[17]。另有研究顯示，大鼠腰脊髓背角淺層神經元對注射5-HT 有反應，5-HT 反應神經元也對多種醛原子有反應[18，19]。有研究表明，對SD 大鼠注射經典的致癢介質組胺，大鼠會出現類似疼痛的表現20]，但對SD 大鼠皮內注射5-HT 后則出現后爪搔抓的行為1]。因此，許多課題組以5-HT 作為致癢劑，建立SD 大鼠瘙癢模型來研究瘙癢的調節機制[17-19]。本研究采用SD 大鼠一次性頸背部皮內注射5-HT 溶液制作瘙癢模型，造模完成約0.5 h 左右，大鼠開始出現明顯的搔抓行為，與空白組比較搔抓次數顯著增多，提示瘙癢模型大鼠復制成功。

目前已確認的5-HT 受體有14 個，每個受體又有很多不同的亞型，有幾種分布在脊髓背根神經節中。5-HT 被認為是誘發疼痛或瘙癢的強力因子[22，23]，在生理或病理狀態下，自延髓頭端腹內側區的中縫大核分出的5-HT 下行通路，可能抑制或促進脊髓背角疼痛或瘙癢信號的傳遞[18]。伴隨各種5-HT 受體亞型的大量發現，對疼痛或瘙癢信號的處理產生更加復雜的影響。5-HT1a 受體是由一種G 蛋白偶練聯受體，由421個氨基酸及1309個堿基對組成。它與G 蛋白偶聯，抑制腺苷酸環化酶（Adenylate Cyclase，AC）的活性，抑或激活磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）進而使磷酸肌醇活化的方式參與細胞功能。5-HT1a 受體主要分布區為中縫核、海馬、腦葉、脊髓背角等部位，可分為突觸前膜和突觸后膜兩種受體，處于突觸前膜的5-HT1a受體又被稱作5-HT1a 自身受體，可調控5-HT 的釋放[23，24]。近來，越來越多研究表明 5-HT1a 受體在 5-HT 神經元調控的中樞神經系統中起到了重要作用，與抑郁、認知功能障礙、精神分裂癥、自然生物鐘紊亂也有一定的關系[17,23]。在臨床試驗研究中發現，使用5-HT3 受體拮抗劑[25，26]或者選擇性 5-HT 再吸收抑制劑[27，28]可緩解膽汁淤積性瘙癢。本研究發現瘙癢模型大鼠SDH 中的5-HT1a 受體表達增加，而麻黃連翹赤小豆湯給藥后，能夠抑制瘙癢模型大鼠SDH 中5-HT1a受體的表達。

GRP 是另一個涉及瘙癢脊髓傳輸的神經肽[18，19,23,29]，是由 27 個氨基酸組成的多肽，在哺乳動物的中樞神經系統和胃腸道中存在較多[29]。它和蛙皮素是同系物，與其特定的G 蛋白偶聯受體結合形成的GRPR，也稱作蛙皮素2 型受體，其在各種生理功能中發揮重要作用。GRPR 在脊髓背角淺層的神經元中表達[30]，當脊髓中表達GRPR 的神經元被切除后，小鼠不能引起任何搔抓行為[31]。研究表明，皮內注射GRP 后激活大鼠一部分脊髓背角神經元，引發大鼠的搔抓行為[32，33]。另有研究表明，通過髓鞘內注射神經毒素，破壞大鼠脊髓背角神經元中GRPR 的表達，可以顯著降低組胺和非組胺誘發的瘙癢感，但不影響疼痛的感覺傳導[32-34]。由此可見，GPR/GRPR 是瘙癢在脊髓中傳到的特異性信號通路。后續研究發現，特異性皮炎患者體內外周血清GRP 表達水平和皮膚瘙癢程度呈正相關[35]，皮內注射GRP 可以激活肥大細胞誘導大鼠的搔抓行為[36]。說明GRP 不僅在脊髓瘙癢信號傳導中有作用，在外周瘙癢信號傳導中也發揮一定作用。本研究同樣發現在瘙癢模型大鼠的脊髓背角中GRPR表達增加，而經麻黃連翹赤小豆湯治療后的大鼠脊髓背角中GRPR的表達明顯降低。

綜上所述，5-HT 是引起瘙癢的介質之一，麻黃連翹赤小豆湯可能是通過調控5-HT1a 受體的表達，抑制其與GRPR 的協同效應從而實現治療瘙癢癥的效果。另外，本課題前期研究表明，麻黃連翹赤小豆湯是通過對肥大細胞脫顆粒的抑制作用，改善變態反應性炎癥，后續研究發現，麻黃連翹赤小豆湯可以經由PAR2-TRPV1 通路干預Ⅰ型變態反應環節，減輕甚至緩解膽汁淤積性瘙癢。然而，瘙癢癥發病機制較復雜，麻黃連翹赤小豆湯是否還能通過其他途徑發揮作用，還有待深入研究。