山楂常見有機氯、有機磷及擬除蟲菊酯農藥殘留的膳食暴露研究＊

金美奇 ，豆小文 ，付延偉 ，秦家安 ，駱驕陽 ，范卓文 ，楊美華 ＊＊

（1. 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所北京 100193；2. 黑龍江中醫藥大學藥學院 哈爾濱 150040）

山楂是薔薇科植物山里紅的干燥成熟果實。果實在秋季成熟時采收、切片及干燥[1]。山楂是中國特有的藥食兼用的植物，其化學成分主要含黃酮類化合物、有機酸，此外還含有微量元素、氨基酸等[2，3]，具有消積化滯、補脾健胃、活血化瘀等功效[4]。現代藥理學的研究表明，山楂具有降脂[5]、保肝降壓[6]、抗氧化[7]、抗動脈粥樣硬化[8]、抗菌、強心[9]等作用。山楂的藥理作用及保健作用使其不僅在中藥的單方及復方制劑中有著廣泛的應用，而且在市售保健品中也備受青睞，繼而山楂被越來越多的研究者所重視，也被越來越多的人食用，為保證人類健康，山楂中的農藥殘留檢測及膳食風險評估是非常有意義的。

近年，中國中醫藥理論逐漸被國內外所認可，中藥材的市場快速國際化[10]，在此趨勢下，山楂的銷售量不斷擴大，需求量也不斷增多，人工培育山楂的產業應運而生，培育面積不斷擴張。在培育山楂的過程中，遭遇病蟲害的現象不可避免，例如紅蜘蛛、葉螨、小食心蟲、白粉病[11，12]等。防治病蟲害的方法主要還是以化學方法為主[13]，培育過程使用的農藥，部分殘留在山楂中或土壤、水中，而這些農藥多是存在不同程度的毒性，一些藥農為防治病蟲害或提高產量而濫用農藥的現象屢見不鮮，又因其中的部分藥農掌握相關農藥使用的知識較少，操作技術不規范等狀況，使得人們食用后對身體健康產生危害的可能性更大。

有機氯農藥，作為廣譜的殺蟲劑，具有高效、穩定性高和價格低廉等特點，曾被大面積使用[14，15]。雖現已被禁用，但由于其不易降解，在水[16]、土壤[17]、食品[18]中被大量檢出。有機磷農藥為有機磷酸酯類化合物，具有持久性強、毒性高的特點，臨床中，常有機磷農藥急性中毒事件發生，并隨著大量的使用，對環境的污染也不斷加重[19，20]。擬除蟲菊酯類農藥是繼有機氯農藥、有機磷農藥后的新興農藥品種，因其具有半衰期較短、廣譜殺蟲的特點[21]，被全世界大范圍使用，有著代替有機氯農藥和有機磷農藥的趨勢。然而，使用的時間越長，慢性毒性的問題就暴露了出來。現下所購買的農藥，大都是多種農藥混合配制，一是為了能夠防止多種病蟲害癥狀；二能防止農作物的抗藥性[22]。隨著生物鏈富集，這些農藥最終殘留在人體的脂肪[23]、血液[24]、乳汁[25]等地，對人體產生生殖毒性[26]、神經毒性[27]、細胞毒性[28]、遺傳毒性[29]等，又有致癌、誘發基因突變的風險。本研究收集不同地區的41批山楂，選取易殘留的3 類20 種農藥采用GC-MS/MS 法進行檢測，參照WHO 和《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量GB 2763—2016》的最大農藥殘留限量，對檢測結果進行膳食風險評估，旨在評估山楂對人體健康所造成的風險，進而能夠為其他農作物的最大農藥殘留限量提出合理化建議，避免農藥濫用現象，防止危害發生。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

本研究的儀器與試藥包括：AB135-S 電子天平（Mettler-Toledo 公司）；7890B-7010 氣相色譜-三重四級桿串聯質譜儀（美國Agilent 公司）；SF-TGL-20A 高速離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；NV-15G氮吹儀（美國 Agela 公司）；ZD-9556 水平搖床（太倉市科教器材廠）；Eppendorf 可調移液槍（德國Eppendorf公司）；WH-861 型渦旋混合器（江蘇太倉華利達公司）；乙腈、冰醋酸（均為色譜純）（美國Fisher Scientific公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠、硅膠、石墨化碳黑（天津艾杰爾公司）；20種農藥標準品均購自農業部環境保護科研監測所，質量濃度為100 μg·mL-1。

檢測山楂樣品分別來源于不同省市共41 批次（表1）。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5MS（0.25 mm × 0.25 μm × 30 m）石英毛細管柱；載氣：氦氣；純度≥99.999%；進樣口溫度280℃；輔助加熱區溫度300℃；程序升溫：初始柱溫60℃，以40℃·min-1升溫至120℃，以8℃·min-1升溫至170℃，再以4℃·min-1升溫至220℃，最后以5℃·min-1升溫至300℃；柱流速：1.2 mL·min-1，進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣。

1.2.2 質譜條件

離子源為電子轟擊源（EI），質譜監測模式為多反應監測（MRM）電壓為70 eV；離子源溫度230℃；接口溫度280℃；溶劑延遲時間4.5 min；碰撞氣：氮氣（純度≥ 99.999%）；安 捷 倫 Mass Hunter software（version B.07.01SP1）工作站。

表1 41批山楂樣品信息

1.2.3 對照品儲備液的配制

精密取敵敵畏、甲胺磷、α-六六六、樂果、β-六六六，γ-六六六、δ-六六六、p,p'-滴滴伊、p,p'-滴滴滴、o,p'-滴滴涕、p,p'-滴滴涕、五氯硝基苯、二嗪磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷、對硫磷、殺撲磷、乙硫磷、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯各20μL置于2 mL離心管中，用乙腈定容至 1 mL，制備成濃度為 2μg·mL-1的對照品儲備液。

1.2.4 供試品溶液的配制

山楂樣品經粉碎后過三號篩，精密稱定3 g，置于50 mL 離心管中，加入15 mL 1%冰乙酸溶液，振搖充分浸潤后放置30 min，精密加入15 mL 乙腈，渦旋震蕩混勻后，加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4:1）7.5 g，立即搖散，震蕩放冷，離心（4000 r·min-1）5 min，移取9 mL上清液，加入預先準備好的凈化材料的凈化管〔無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺（PSA）300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化碳黑90 mg〕中，渦旋震蕩混勻后，離心（4000 r·min-1）5 min，精密移取 5 mL 上清液，氮吹儀上40℃濃縮后，加入乙腈定容至1 mL，0.22μm 微孔濾膜過濾取續濾液，即得。

1.2.5 基于理論最大殘留限量的風險評估

根據2015版《中華人民共和國藥典》第一部中，規定山楂用量每天9-12 g，按最大服用量12 g 計。計算每日允許限量（ADI）值，按照如下公式計算[30，31]，式中NEDI：國家估計每日攝入量（mg·kg-1·b.w.-1）；STMRi：第i類初級食用農產品的規范實驗殘留中值（mg·kg-1）；Fi：第i類食品消費量（g·d-1）；bw：人均平均體重（以60 kg計）；%ADI：長期攝入風險。

我國自20世紀80年代開始，逐步推進計劃免疫工作，至今近40年，對保障我國人民健康，提高公民的整體健康水平發揮著巨大的作用[1] 。而隨著近年來我國人民生活水平的顯著提高，醫學模式的明顯改變，人們對預防接種重要性的認知程度大為提高，兒童預防接種工作也備受關注[2] ，這對于有效預防兒童發生某些傳染病具有積極的意義。然而仍有部分兒童家長對預防接種的認識程度不足，兒童預防接種的依從性較差，這就導致一些兒童未能及時的進行預防接種，進而埋下一定的隱患。筆者近年來即針對預防接種兒童實施了優質護理以提高其預防接種的依從性，效果滿意，現報告如下。

2 結果與討論

2.1 提取方法的選擇及檢測條件的優化

本研究的前處理方法，參照2015 版《中華人民共和國藥典》第四部中，通則2341 農藥殘留量測定法項下中第4 法。提取溶劑為乙腈，山楂中待測農藥包括有機氯、有機磷和擬除蟲菊酯3類，農藥極性覆蓋中等到弱極性范圍，乙腈作為農藥多殘留標準分析方法的首選提取溶劑，與大多數農藥理化性質相近，能夠滿足提取要求；凈化過程中采用的QuEChERS 法是具有快速、簡單、廉價、高效、耐用和安全的多種類多殘留農殘檢測的凈化方法[32]，此法能夠滿足檢測中全部農藥的回收率；檢測儀器方法采用GC-MS/MS 氣相色譜-三重四級桿串聯質譜法，相當于在GC-MS 的基礎上增加二級子離子的質譜信息，能夠增強結構解析和定性的能力，為定性分析提供豐富的結構信息，并且該法在常規兩對定性離子的基礎上，增加了一對定性離子，使得分析結果準確可靠[33，34]，20種農藥成分的保留時間、監測離子對、碰撞電壓（CE）參考值見表2。該方法優勢在于高效、靈敏、準確，不僅適用于山楂中的農藥殘留檢測，還適用于遠志、款冬花、苦參等中藥材。

2.2 方法學考察

2.2.1 基質效應

山楂中化學成分復雜，在前處理過程中雖加入不同凈化吸附劑凈化基質，但不能將基質完全消除。不論是基質的種類或是含量都有可能會影響回收率，即使在實驗方法和儀器操作條件相同的情況下，每種農藥的回收率也不同，在結果上表現為基質增強效應或基質減弱效應[35]。建立添加水平為1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.1 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.02 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1、0.005 μg·mL-1、0.002 μg·mL-1的溶劑標準曲線和基質匹配校準曲線，計算兩條標準曲線的斜率，進行基質效應考察。在本實驗中，20 種農藥均存在基質增強效應，基質增強效應見圖1。因此，山楂具有基質增強效應，避免結果不準確，應建立基質匹配校準曲線。

2.2.2 線性回歸方程

為避免基質效應影響檢測結果，選擇建立基質匹配校準曲線。精密量取對照品儲備液適量，逐級稀釋制備成含各對照品為 1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.1 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.02 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1、0.005 μg·mL-1、0.002 μg·mL-1不同濃度系列的基質混合對照品溶液，按照1.2.1 和1.2.2 項下方法進行測定。以峰面積為縱坐標（Y），對照品濃度為橫坐標（x），繪制農藥標準曲線。在農藥濃度范圍1-0.002 μg·mL-1內線性關系良好，相關系數r2≥ 0.997。

表2 20種農藥殘留的保留時間、監測離子對及碰撞電壓（CE）

續表

2.2.3 靈敏度實驗

稀釋適宜倍數混合對照品儲備液，低濃度的對照品混合液按照1.2.1 和1.2.2 項下的方法進樣測定，根據信噪比調整進樣濃度，當信噪比（S/N）為3時作為儀器的檢測限；當信噪比（S/N）為10 時作為儀器的定量限。

2.2.4 精密度實驗

精密度是保證準確度的先決條件，配制0.1 μg·mL-1的混合標準品溶液，按照1.2.1和1.2.2項下的條件于氣相-質譜聯用儀中重復進樣6次，計算各個農藥峰面積及RSD（%）值，結果見表3。

2.2.5 添加回收率實驗

選取山楂陰性樣品，進行添加回收實驗。按照1.2.4 項下供試品溶液制備方法，分別制備混合對照品添加水平為0.2 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1、0.05 mg·kg-1的添加樣品，每個水平重復3 次，計算添加回收率及RSD（%）值，結果見表4。結果表明，添加回收率在75.7%-110.2%，精密度（以RSD值計）小于6.56%，結果滿足測定要求。

2.3 檢測結果分析

2.3.1 樣品中農藥殘留檢測結果

圖1 20種農藥在山楂中的基質效應

在檢測的20 種農殘中，共8 種有檢出，分別為甲基對硫磷、馬拉硫磷、p,p'-DDE、p,p'-DDD、乙硫磷、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯，其中滴滴涕、甲基對硫磷為國家禁止生產和使用的農藥，氰戊菊酯為國家限用農藥。p,p'-滴滴伊、p,p'-滴滴滴、乙硫磷、溴氰菊酯，雖有檢出但未到定量限，不能準確定量。從檢測樣品中的檢出率看，氯氰菊酯陽性率最高；從檢出量總體平均值來看，殘留水平最高的為氰戊菊酯。20 種農藥殘水平及結果分析見表5。雖然有機氯類農藥在我國早已禁用，但由于其不易降解，易在土壤中殘留，因而在部分樣品中仍有少量檢出。有研究文獻報道，在山楂培育過程中為防治紅蜘蛛、葉螨等病蟲害，會噴灑一定濃度的多種擬除蟲菊酯類農藥或有機磷農藥的混合溶液[36-38]，若噴灑劑量過大或次數過多，就會對山楂造成不同水平的農藥殘留。

2.3.2 基于膳食暴露量的風險評估

由于山楂并無檢測農藥的殘留限量標準，因此參照WHO 和《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量GB 2763—2016》中提供的最大殘留限量（MRLs）值，對山楂進行膳食暴露風險評估，實際樣品農藥殘留量小于理論最大殘留量為安全，安全性評價結果見表6。從檢出的結果分析來看，除氰戊菊酯外，其余7種的樣品安全率為100%，氰戊菊酯的樣品安全率為68%，41 批樣品中有13 批不在安全范圍內，與前面的樣品檢測結果相結合分析，應重點監控擬除蟲菊酯類農藥。

表3 20種農藥線性回歸方程（r2）、精密度、檢測限及定量限

表4 20種農藥添加水平（n=3）、回收率（%）及RSD值（%）

表5 41批山楂樣品中20種農藥殘留檢測結果

3 結論

山楂中農藥殘留狀況及最大殘留限量的合理建議：本研究所收集的山楂樣品為凈山楂，即已經過采收、儲存、運輸、加工除核及包裝等工序后才為所用，在這些繁瑣的工序中被直接污染或間接污染的途徑有很多。與此同時，山楂制品也不僅在制藥中，食品中也廣泛應用。為檢測結果可靠，本研究收集了不同產地的凈山楂樣品。從檢測數據上看，樣品總殘留量最大的為氰戊菊酯其次為氯氰菊酯，菊酯類農藥應屬于高效、低殘留的農藥，但部分檢出量仍高出理論最大殘留量，為避免農藥濫用情況出現，應嚴格控制施用次數和用量。從檢測樣品上看，樣品檢出率最高的同樣為氰戊菊酯，其次為氯氰菊酯，雖然擬除蟲菊酯類農藥為低毒農藥，但長期大量攝入仍存在慢性毒性[39，40]。

表6 基于理論最大殘留限量的農藥風險評估

另外，需要注意的是，“ND”并非是沒有殘留，不能相當于“0”值，其潛在的風險不能確定。山楂作為藥食同源的植物，日常飲食量可能遠超過藥用劑量，同時，檢測結果也說明，擬除蟲菊酯類農藥僅在食品中規定最大殘留量值是遠遠不夠的，同樣也應該在中藥材中制定最大殘留量值，登記使用種類，限制使用量及施用次數，防止藥液殘留到水或土壤中，同時相關部門應重點監管，才能有效保障人體健康。