四種大宗常用中藥飲片中黃曲霉毒素污染狀況分布比較研究＊

單利楠 ，王玉丹 ，豆小文 ，段亞萍 ，楊世海 ，王建華 ，楊美華 ＊＊

（1. 中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所 北京 100193；2. 吉林農業大學中藥材學院 長春 130118；3. 山東農業大學農學院 泰安 271018）

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)是一類有毒次生代謝產物，由多種真菌毒素代謝產生，如黃曲霉Aspergillus flavus和寄生曲霉A.parasiticus等。毒性較強的有黃曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（AflatoxinB2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（AflatoxinG1，AFG1）、黃曲霉毒 素 G2（AflatoxinG2，AFG2）[1，2]。 其 中 AFB1的 毒 性 最大，屬于I 類致癌物，分布最廣，其毒性是氰化鉀的10倍，對肝臟有明顯損傷作用，能誘發原發性肝癌，具有致癌性、致畸性和致突變性[3-5]。

中藥材在種植、采收到貯藏等過程中容易受到產毒真菌的侵害，導致黃曲霉毒素的產生。為保障中藥的用藥安全，國內外制定了相應的限量標準，《中國藥典》（2015年版，一部）對麥芽、大棗、肉豆蔻、水蛭和地龍等19 種中藥品種進行了限量控制，規定AFB1限量為5 μg·kg-1，AF（B1+B2+G1+G2）限量為10 μg·kg-1；歐盟規定辣椒、肉豆蔻、干姜、姜黃中AFB1限量為5 μg·kg-1，AF（B1+B2+G1+G2）限量為10 μg·kg-1；德國、中國香港規定中藥材中 AFB1限量分別為 2 μg·kg-1和 5 μg·kg-1，AF（B1+B2+G1+G2）限量分別為4 μg·kg-1和10 μg·kg-1[6,7]。

近年來，中藥材中AFs污染的報道較多，Wang等[8]檢測了中國不同地區的12 批甘草和9 批貝母，結果顯示2 批甘草根（陜西定邊和甘肅慶陽）和1 批貝母（四川松潘縣）呈陽性。Liu 等[9]從中國海南省不同市場收集了 40 批巴戟天，檢測了其真菌毒素，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、伏馬毒素（Fumonisins，FB2）和桔青霉素（Citrinin，CIT）在其中2批樣品中檢出。Yang等[10]檢測了水蛭、全蝎、蜈蚣、土鱉蟲等17 種動物藥中AFs 殘留水平，其中僵蠶中檢出 AFG1的含量為1 μg·kg-1，土鱉蟲中檢測出 AFs 和 AFB1的含量分別為 6.4 μg·kg-1、1.1 μg·kg-1。此外，一些藥食兩用的中藥（如蓮子、薏苡仁等）中AFs的污染較為嚴重，如不經控制被人們食用，則會導致嚴重的不良反應，故中藥材中黃曲霉毒素污染不可忽視[11-13]。

目前，常用于中藥中AFs 的檢測方法主要有薄層色譜法（Thin-layer chromatography，TLC），酶聯免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），高效液相色譜-熒光檢測器法（High performance liquid chromatography with fluorescence detection，HPLC-FLD），超高效液相色譜-熒光檢測器法（Ultra-high performance liquid chromatography with fluorescence detection，UHPLCFLR），液相色譜-質譜聯用法（Liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）等[14-18]，其 中 HPLC-FLD 法 結 合 免 疫 親 和 柱（Immunoaffinity column，IAC）凈化過程是目前檢測AFs 的最常用方法之一。中藥基質較為復雜，化學成分種類較多，日常檢測中基質干擾、適用性較差、靈敏度低和專屬性差（假陽性）等問題通常不可避免[19]。IAC 以其高特異性、高效率、專屬性強的特點成為AFs殘留分析的首選凈化方法，單克隆抗體抗原之間的特異性吸附是其主要原理，于許多復雜樣品基質凈化中應用成功[20]。在線柱后光化學衍生法是AFs 檢測時用來增強黃曲霉毒素B1和G1的熒光強度的一種手段，光化學衍生裝置相比較碘衍生裝置在不需要增加額外的泵輸送衍生化試劑的條件下可直接連在色譜柱和熒光檢測器之間，操作簡便且靈敏度高[21-23]。故本文采IAC樣品凈化方法和HPLC-FLD檢測方法對選取的4 種大宗常用中藥材（包括柏子仁、薏苡仁、決明子和黨參）測定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2含量，并在《中國藥典》（2015 年版，四部）基礎上改進前處理方法，采用LC-MS/MS對陽性樣品進行確證，為4種中藥中AFs的含量測定和質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 設備與耗材

設備與耗材詳見表1。樣品：柏子仁（platycladi seeds）：34 批；薏苡仁（Coix seed）：14 批；決明子（Cassia）：15 批；黨參（Codonopsis pilosula）：12 批（表2）。以上樣品均由藥用植物研究所楊美華研究員鑒定。

表1 設備與耗材

1.2 實驗方法

1.2.1 AFs標準溶液的配置

精密量取0.1 mL 高濃度AFs 混合對照品，置于1 mL 容量瓶中，加甲醇定容后作為儲備液。精密量取儲備液，用50%甲醇稀釋儲備液至系列濃度作為混合標準溶液使用。

1.2.2 樣品溶液的制備

精密稱取藥材粉末（過2 號篩）約5 g 于50 mL 離心管中，加入NaCl 1 g，甲醇-水（70：30，v/v）溶液25 mL，超聲提取 15 min，10000 r·min-1離心 5 min，移液管量取5 mL 上清液置于50 mL 量瓶中，用水定容，搖勻，上清液過0.45 μm 濾膜，收集續濾液。精密量取40 mL續濾液通過免疫親和柱，流速3 mL·min-1，用10 mL 純水洗脫盡雜質，最后用2 mL量瓶收集甲醇洗脫液后定容至刻度，混勻，過0.22 μm濾膜，備用。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：Cloversil ODS-U（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；流動相：甲醇-乙腈-水（40∶18∶42），流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃；熒光檢測（激發波長360 nm，發射波長450 nm）；進樣量：10 μL。

1.2.4 MS條件

色譜柱:CAPCELL CORE C18 column（100 mm ×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：A 相：甲醇（0.1%甲酸）B 相：50 mM 乙酸銨水（0.1%甲酸）；梯度洗脫程序如下：0.01 - 0.50 min，B 相 60%，0.50 - 4.50 min，B 相 60% -5%，4.50-6.50 min，B相5%，6.50-6.51min，B相5%-60%，6.51 - 10.00，B 相 60%；進樣量：2 μL；流速：0.3 mL·min-1。

電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI），正離子模式；離子噴射電壓（Ion spray voltage，IS）4500V；離子源溫度（Ion source temperature，TEM）500℃；霧化氣（Nebulizer gas, GS1）壓力 55 psi，加熱氣（Heater gas，GS2）壓力55 psi，氣簾氣體（Curtain gas，N2），壓力35 psi。掃描方式為多重反應監測（Multiple reaction monitoring，MRM）。4 種檢測成分的離子對質荷比：AFB1（313/285/254）、AFB2（315/287/259）、AFG1（329/311/243）、AFG2（331/245/217）。去簇電壓（Declustering potential，DP）分別為 110，170，130，130 V；碰撞能量（Collision energy，CE）分別為32/43，36/40，37/44，40/48。

2 結果與討論

2.1 系統適應性考察

分別取混合對照品、柏子仁、薏苡仁、決明子、黨參樣品溶液在上述色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖（圖1）。待測物各色譜峰峰型較好，且與相鄰峰之間分離度良好，均大于1.5，達到定量要求。

2.2 線性關系

精密量取儲備液，用甲醇-水（50∶50，v/v）稀釋儲備液至系列濃度作為混合標準溶液使用（AFG1，AFB1濃度為 0.25-25 ng·mL-1；AFG2，AFB2濃度為 0.0625-6.25 ng·mL-1），以 10μL 的進樣量進樣，記錄 4 種毒素不同濃度色譜圖。以濃度、峰面積分別作為橫、縱坐標以繪制標準曲線，計算得到AFG2，AFB2的線性回歸方程分別為：y=50215x+1435.1；y=81614x+759.4，線性范圍：0.0625-6.25 ng·mL-1，計算得到AFG1，AFB1的回歸方程分別為：y=23159x+1424.6；y=36325x+192.2，線性范圍：0.25 - 25 ng·mL-1，線性相關系數R2均大于0.9996。

2.3 方法的精密度、重復性和穩定性

取供試品藥材粉末(過2 號篩)約5 g，精密稱定，加入以AFB1濃度計算濃度為5 μg·kg-1的混合對照品溶液，然后按照1.2.2 項下樣品溶液的制備的方法制備供試品溶液，取供試品溶液在相應的條件下重復進樣6次，每次進樣10 μL，測定四種毒素AFG2，AFG1，AFB2，AFB1的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值分別為2.30%、1.34%、1.02%、0.92%，表明儀器精密度良好能夠用于定量分析。

圖1 樣品及標準溶液HPLC圖

為了考察四種毒素在陰性中藥飲片樣品提取液中的重復性，精密稱取同一批次的藥材粉末約5 g，共6份，加入相同濃度混合對照品溶液，然后按照上述前處理方式處理樣品，并進行色譜條件測定，樣品中4組分峰面積的RSD低于15%。

為了考察四種毒素在陰性中藥飲片樣品提取液中的穩定性，取上述供試品溶液，于0，6，12，18，24 h時間點分別進樣測定，每次進樣10μL，計算四種毒素峰面積比的RSD 值，低于2.0%，表明各毒素在中藥樣品提取液中的穩定性良好。

2.4 檢測限和定量限

將混合對照品溶液按比例稀釋成更低濃度，進樣測定。根據信噪比（S/N）峰響應值，以大于3倍信噪比和大于10 倍信噪比計算定為最低檢測限和最低定量限，該方法的檢測限為0.11 μg·kg-1（AFG2），0.56 μg·kg-1（AFG1），0.10 μg·kg-1（AFB2），0.40 μg·kg-1（AFB1）；該方法的定量限為0.33 μg·kg-1（AFG2），1.50 μg·kg-1（AFG1），0.33 μg·kg-1（AFB2），1.22 μg·kg-1（AFB1），靈敏度較好。

2.5 加標回收率

通過回收率實驗來考察方法對黨參、決明子、薏苡仁、柏子仁4 種中藥樣品的的提取效率，取4 種樣品的陰性藥材粉末（過2 號篩）約5 g，精密稱定，分別精密加入3 種不同濃度的AFG1，AFB1（2.5，5.0 和10 μg·kg-1），AFG2和AFB2（0.625，1.25 和2.5 μg·kg-1）進行加標測定。按1.2.2項下實驗方法制備供試品溶液，計算回收率。結果顯示4 種中藥的AFs 的平均加標回收率均在80% -120%之間，RSD 低于13%，表明該方法準確度良好。

2.6 樣品含量的測定及液質確證

34 批柏子仁樣品檢測結果顯示：26 批陽性，AFs、AFB1、AFB2、AFG1的檢出范圍分別為 1.22 - 46.67 μg·kg-1，1.22 - 31.40 μg·kg-1，0.41 - 3.22 μg·kg-1，2.09 -2.60 μg·kg-1，其中 1 批樣品 AFG2的檢出值 10.47 μg·kg-1。8 批 AFs 總量超標，超標率 24%，10 批 AFB1陽性超標，超標率29%；14 批薏苡仁樣品中4 批檢出陽性，AFB1、AFB2檢出范圍分別為1.97-36.4 μg·kg-1，0.85-4.73 μg·kg-1，其中2批檢出陽性且超標，超標率14%；15批決明子樣品中1批AFB1（12.6 μg·kg-1）檢出陽性且超標；黨參樣品不受黃曲霉毒素感染，具體檢測結果見表1。從檢測結果看，4種大宗常用中藥飲片中易污染AFs程度依次為柏子仁、薏苡仁、決明子和黨參。AFB1、AFB2在以上3 種中藥中被檢出，而柏子仁樣品檢出了AFG1和AFG2。針對污染程度高的中藥飲片，在加強監控的同時，應適當增加對該藥材的AFs 抽檢率和抽檢頻次，同時分析AFs的污染途徑，解決污染防控問題。

表2 75批中藥飲片中AFs測定結果

續表

圖2 樣品及標準溶液LC-MS/MS圖

從藥材外觀來看（表2），黨參外觀淡黃色，未出現發霉跡象，且無毒素檢出；薏苡仁作為藥食同源產品，包裝整潔干凈，藥材外觀呈乳白色，無發霉現象，盡管如此，仍有部分被檢出AFs，且超過限量標準，如長期食用有安全風險；決明子外觀黃褐色，均未出現發霉跡象，但有1批被檢出AFs；柏子仁中AFs檢出率最高，表面黃白色或淡黃棕色，部分顏色深棕色，個別出現泛油現象，但其表面無發霉現象。從以上4 種中藥飲片檢測結果及外觀性狀觀察推測，中藥材外觀形狀與真菌毒素污染無因果關系。此外，比較不同的中藥基質發現AFs 污染差異性較大，黨參是根和根莖類中藥材的代表，薏苡仁、決明子、柏子仁則代表果實種子類中藥材，而同時薏苡仁、柏子仁又是藥食兩用中藥材），薏苡仁、柏子仁被AFs污染的頻率較高，與以往研究者李峻媛等檢測結果相符[24,25]；柏子仁與薏苡仁本身所含有的成分可以為霉菌的生長提供充足的養分，產毒真菌在這兩種油脂與淀粉類基質中容易大量繁殖，導致AFs 污染率高[26]。黨參上AFs 均未檢出，與蘇春燕等[27]的實驗結果一致，而譚婧等[28]報道黨參中AFG2檢出值為471μg·kg-1。

本研究采用LC-MS/MS法對上述陽性樣品進行確證（圖2）。AFB1、AFB2的準分子離子峰分別為m/z313[M+H]+、m/z315[M+H]+，準分子離子峰下對應選擇 2 對特征子離子碎片為m/z285[M+H-CO]+和m/z254[M+H-CO2]+、m/z287[M+H-CO]+和m/z259[M+H-2CO]+，由圖2可知樣品與標準品溶液的相應色譜峰保留時間相同，子離子的質荷比一致，供試品溶液的定性離子相對豐度比與濃度相當的對照品溶液的定性離子相對豐度比之間的相對偏差不超過藥典規定的范圍，保證了測定結果的準確性，排除了樣品的假陽性。

3 結論

本文為同時滿足柏子仁、薏苡仁、決明子和黨參4種不同中藥基質的檢測要求，在參照藥典的基礎上改進了樣品前處理，提高了真菌毒素定量檢測結果的準確性，實驗結果顯示回收率均可達到80-120%，RSD ＜13%。本研究所檢測的75 批中藥中31 批AFs 檢出陽性，陽性率41%。其中，11 批AFs 陽性超標，超標率15%；13 批AFB1陽性超標，超標率17%。《中國藥典》（2015年版，一部）對19種中藥的黃曲霉毒素有限量規定，包括柏子仁、薏苡仁、決明子等，而本研究表明不同中藥基質AFs 污染程度不同，柏子仁中AFs 污染程度最高，薏苡仁、決明子、黨參污染程度依次遞減，其原因包含內在與外在兩方面因素，內在因素為藥材本身所含成分等是否適宜真菌毒素的生長，外在因素則包括藥材生產所需特殊的初加工方式等相關，提示應對易污染AFs 中藥加強監控。中藥外觀性狀改變和AFs污染與環境、基質、初加工方式等多因素綜合作用相關，需分析總結真菌毒素污染的關鍵環節（包括生產、加工、儲藏、運輸等方面），并進行深入研究，以便預警和細化防控，保障中藥的質量和安全。