基于ITS2條形碼及其二級結構的菊科藥用植物的系統發育分析＊

韓芳平，謝才友，蘭 卓，任瑤瑤，譚 睿

（西南交通大學生命科學與工程學院 成都 610031）

菊科（Compositae）是比較年輕且進化程度較高的一個大科，在數量和分布范圍上均居世界之冠，是被子植物中最大的科[1]，約 1000 多屬，25000-30000 種，我國約200多屬，2000余種[2]。菊科植物味甘苦、性寒,具有疏風、清熱、解毒的功效,可用來治療感冒引起的頭痛發熱，心胸煩悶。其提取物如倍半萜內酯具有抗腫瘤、抗瘧和防治心血管疾病等方面的作用，其他提取物也多具消炎、抗凝、鈣拮抗等生物活性[3]。

以往對于植物的鑒定與分類，多基于專業人員在形態學方面的觀察，需要鑒定人員大量實踐經驗的積累，且制約著植物鑒別的精度與效率。2003 年加拿大生物學家Hebert 等[4]提出了DNA 條形碼技術，利用來自標準基因組區域的短序列來識別物種，為生物分類提供了新的技術手段，成為了分類學的里程碑[5-6]。內部轉錄間隔區（Internal transcribed spacer，ITS2）是核基因[7]，包含由 5.8SrDNA 分隔的 ITS1 和 ITS2，其中ITS2 序列片段較短，容易與單對引物結合，易于測序與擴增，且種間變異度高，在物種和亞種水平上的識別信息最為豐富[8]。此外，ITS2 二級結構的分子形態特征甚至允許ITS2 區域在測序錯誤及假基因出現的情況下保持高準確度[9]，因此可靠性高，并作為物種新的可識別特征，為分類和精確識別奠定基礎[10，11]。Gao等[12]的研究表明，在rbcL、matK、ITS1、ITS2、psbA-trnH這五種DNA 區域中，ITS2 在菊科植物的廣泛性、序列變異和鑒定能力方面最有效，因此本實驗采用ITS2 作為條形碼進行鑒別。

藥用植物有些經過加工炮制后外形特征丟失，與其近緣種外形及其相似，鑒定困難[13]。市場上流通的菊科藥材也存在混偽、摻假現象。而菊科藥用植物在《中國植物志》中有7 卷11 冊之多，種類繁多更加不易區分。本實驗擬使用ITS2 對于川藏地區的常見菊科藥用植物進行鑒別。

本實驗基于ITS2 作為條形碼的手段，通過對西藏自治區、四川峨眉、樂山、康定等地區采集的菊科植物樣本及Genbank 下載的序列進行遺傳距離、NJ 系統進化樹的分析以及ITS2 二級結構的比較，對菊科藥用植物進行較為準確的分類，避免了菊科植物的混淆，同時也為菊科植物在資源和種源的利用和保護方面提供了理論依據。

1 材料

從四川省峨眉山、樂山、康定及西藏自治區采集了46份菊科植物標本，經西南交通大學生命科學與工程學院宋良科副教授鑒定，牛蒡子（Arctium. lappa）3份，天名精（Carpesium abrotanoides）2 份，貴州天名精（Carpesium abrotanoides）2 份 ，艾 納 香（Blumea balsamifera）1 份，緣毛紫菀（Aster souliei）1 份，鬼針草（Biden.s pilosa）1份等，標本詳情請見表1。

2 方法

2.1 樣品DNA提取、PCR擴增及測序

取藥材干重組織約30 mg,加入液氮充分碾磨，使用植物 DNA 提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA，提取步驟按照試劑盒說明。

以樣品DNA作為模板，對ITS2進行PCR擴增：

正向引物ITS2F5'ATGCGATACTTGGTGTGAAT3';

反向引物ITS3R，5'GACGCTTCTCCAGACTACA AT3'。

PCR 反應條件:①94℃變性 5 min；②94℃變性30 s；③56℃退火30 s；④72℃延伸7 min；⑤重復上述步驟40 次；⑥72℃延伸10 min。將PCR 產物送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序[14]。

2.2 數據處理

基于隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMMer）注釋ITS2 序列，從而獲得標準的ITS2 間隔區序列。所有ITS2序列用MEGA7.0進行種內、種間K2P（Kimura 2-parameter）遺傳距離的計算，并基于K2P 距離使用相鄰結合法（Neighbor Joining，NJ）構建系統進化樹[15]。利用靴帶（Booststrap）法1000 重復檢驗各分支的支持率。在Koetschan[16]等建立的ITS2 數據庫網站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de)預測各樣本ITS2序列二級結構。

3 結果

3.1 序列長度及種內、種間K2P遺傳距離分析

用MEGA7.0 對所有樣品序列及下載的序列進行比對，結果表明ITS2 序列長度在209-233 bp 之間，全序列排序比較長度為242 個位點,GC 含量在48.9%-64.1%范圍內（表1）。

物種間、種內的遺傳距離越小，同時物種間遺傳距離越大，則其用DNA 條形碼進行分類和鑒定的效果越理想[17，18]。應用 MEGA7.0基于 K2P 模型計算所有樣品種內和種間遺傳距離，種內遺傳距離為0-0.009，種間遺傳距離為0.031-0.727，其中種內最大遺傳距離為0.009，種間最小遺傳距離為0.031，種間遺傳距離遠大于種內遺傳距離。

熱圖結果顯示（圖1），菊科樣品種內，屬內K2P 遺傳距離小，在熱圖中顏色淺；各屬之間遺傳距離大，在圖中為顏色較深的區域；其中紫菀屬與其他屬遺傳變異值較大，在熱圖中所對應的區域顏色最深。

統計并分析樣本種間和種內遺傳距離的分布情況發現，不同樣本間存在較大的barcoding gap，表明ITS2 序列對供試樣本在種水平具有較強的鑒定能力。從圖2中還可觀察到種間變異距離值主要集中在0.1-0.6 之間，其中0.1-0.2 區間主要由艾納香屬和天名精屬遺傳距離組成，0.2-0.3 這一區間主要是石胡蔞屬、牛蒡子屬與蒿屬之間的遺傳距離組成，0.3-0.4區間主要由天名精屬、鬼針草屬、艾納香屬和蝟菊屬的遺傳距離組成，而0.4-0.6之一區間主要是紫菀屬與其他各屬的遺傳距離，這一結論也與熱圖所得結果一致。

3.2 NJ樹分析

用MEGA7.0 對ITS2 基因進行序列比對并構建NJ系統聚類樹，利用靴帶（bootstrap）檢驗法1000 次檢驗各分支支持率，結果見圖3。由NJ 樹可看出個樣本聚為兩大支，蒲公英屬蒲公英與其他各屬種分開為2支，單成1 支，另1 支包含17 屬23 種。各屬內各種聚為小支，聚類效果整齊準確，單系性好；并且可分別觀察到鬼針草屬與蒼耳屬，蝟菊屬與牛蒡子，千里光屬與蟹甲草屬，火絨草屬與鼠麴草屬親緣關系較近。分支之間靴帶檢驗法支持率在50%以上，可見ITS2條形碼在對樣本18屬24種可在種的水平上很好地區分。

表1 菊科植物樣本信息

圖1 菊科植物樣本種間和種內距離

表2 GenBank下載菊科植物ITS2序列

圖2 菊科植物樣本ITS2 序列種內和種間變異分布

3.3 ITS2二級結構的分析

圖3 基于ITS序列構建的菊科植物樣本的NJ樹

根據ITS2 數據庫及其網站預測供試菊科藥用植物ITS2 二級結構（圖4）。所有二級結構均為1 個中心環（主環）及4 個螺旋區（helix）組成，每個螺旋區又具有數量不一、大小有別的莖環（loop）結構。由二級結構可以看出，黃花蒿、鬼針草、天名精、鼠麴草、羽裂絹毛苣、緣毛紫菀與蒲公英二級結構相似，但其在中心環的大小、形狀以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ螺旋區的莖環數量、大小及位置均有差異，可以彼此區分。其中緣毛紫菀比其他幾個相似的二級結構在Ⅰ、Ⅲ區莖環數多且形狀更大，區別明顯。艾納香、貴州天名精、牛蒡子、石胡蔞、火煤草和蒼耳二級結構的中心環相似，其中Ⅱ區結構也相對保守，但Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ區莖環數目、大小存在明顯差異。

在進行對樣本ITS2 二級結構的比較時，可以發現二級結構的相似性和種屬關系無關，即使一個屬的物種，如天名精與貴州天名精，其二級結構依舊差異顯著。一些樣本的種間二級結構相似，但在中心環及4個螺旋區仍存明顯差異，可以將各供試樣本直觀鑒別出來。

4 討論

菊科植物在我國品種繁多，資源豐富，含黃酮、萜類、生物堿等化學成分，具有清熱解毒、散瘀止痛、祛風除濕等功效，在預防心血管疾病及抗腫瘤方面也有巨大的潛在價值[3,19]。屠呦呦等對菊科中藥青蒿的化學成分進行了深入研究，分離了倍半萜內脂、黃酮醇、香豆素、青蒿酸，以及具有治療支氣管炎的有效藥物青蒿揮發油，其中最重要的是具有抗瘧功能的有效成分青蒿素[20]。艾蒿可止血安胎，是婦科常用中藥[21]。紫菀可潤肺下氣，化痰止咳，而鬼針草、千里光等具有清熱解毒，活血祛風的功效[22]。目前很多菊科植物資源仍處于零星采集的狀態，未得到合理、充分的開發與利用[23]，因此對菊科植物建立快速準確的鑒定方法是十分必要的。

圖4 菊科ITS2 序列的二級結構

ITS2作為一種通用的DNA 條形碼，已被用于藥用植物及其近緣種的鑒定[24，25]。此鑒定方法具有快捷、準確、對形態學分類技術要求不高的特點[26]。本研究對44 份樣本進行DNA 提取、PCR、測序，并成功獲得ITS2序列，結合GenBank 上下載的17條菊科藥用植物ITS2 序列，基于ITS2 對菊科藥用植物樣本分析。使用MEGA7.0 軟件對種內、種間K2P 種內遺傳距離進行計算。計算結果為種內遺傳距離0-0.009，種間遺傳距離為0.031-0.727，種間遺傳距離明顯大于種內遺傳距離，說明可以使用ITS2對供試樣本進行分析鑒別。

基于K2P 遺傳距離構建NJ 樹可觀察到18 個屬聚成兩大支，各屬又各自成束，單系性良好，可以明顯區分各屬樣本，同時能夠觀察到不同屬親緣關系的遠近程度。利用ITS2 數據庫分析各樣本ITS2 序列二級結構，分析結果表明ITS2 序列可以對菊科藥用植物進行準確的鑒定，盡管一些樣本間二級結構相似，但仍具各自特征，可以直觀、準確地進行區分。并且在某些樣本質量少、DNA 提取效果不佳的情況下也可獲得雙向序列并成功分析，并不影響實驗結果。

本研究結合了DNA 條形碼技術對川藏地區部分菊科藥用植物進行了鑒定，結果證明ITS2 可以穩定、準確地鑒定菊科植物，也為菊科植物的安全藥用提供了基礎。但是ITS2 對植物的分類鑒別需要在大量樣本序列的基礎上進行，因此在樣本采集方面有一定難度和數量、質量上的要求，本研究僅采集了川藏地區部分菊科植物進行鑒定，對于數量眾多的菊科藥用植物的研究有待更多樣本的采集和深入研究，將更有利于菊科藥用植物的開發與利用。