親和萃取法篩選延胡索水提液中的活性成分＊

駱 晶，孟 雪，胡衛(wèi)濤，高秋潔，張選國，李警卓＊＊

（1. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院 西安 710003；2. 陜西省中醫(yī)藥研究院 西安 710003）

高通量中藥活性成分篩選技術(shù)是推進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程的核心環(huán)節(jié)[1]?，F(xiàn)有中藥活性成分篩選方法主要包括：傳統(tǒng)成分分離及活性追蹤篩選、血清藥物化學(xué)和血清藥理學(xué)、代謝組學(xué)、生物色譜技術(shù)、芯片技術(shù)和計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù)等[2-8]。傳統(tǒng)成分分離及活性追蹤篩選方法需對中藥化學(xué)組分進(jìn)行提取、分離與鑒定，利用不同藥理模型對每種化學(xué)成分進(jìn)行生物活性篩選，以確定中藥的有效成分，但該方法盲目性較大，易忽視中藥的系統(tǒng)性及整體性。血清藥物化學(xué)和血清藥理學(xué)篩選方法在一定程度上可反映中藥成分在體內(nèi)的變化過程，但富集、檢測及分離血藥濃度較低的組分具有一定難度，且入血成分的藥效并不明確，代謝產(chǎn)物會隨時間有所變化。代謝組學(xué)篩選方法是現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)研究必不可少的一種方法，能從代謝整體角度闡明中藥與體內(nèi)物質(zhì)的相互作用關(guān)系，在一定程度上了克服上述兩種方法的不足，但都具有工作量大、周期長的特點(diǎn)，并難以應(yīng)用于有潛在藥效活性的微量成分篩選。生物色譜技術(shù)是將細(xì)胞、靶蛋白、核酸等生物大分子固載至色譜填料表面，作為親和色譜固定相，中藥提取液通過裝填有該親和填料的色譜柱后，活性成分被富集于色譜柱內(nèi)，非活性成分由于未與靶標(biāo)分子發(fā)生反應(yīng)而最先被流動相洗脫，從而使得活性成分富集、分離與鑒定[7]?；蛐酒夹g(shù)是指將核酸片段固載至硅片等支持物表面，通過分子標(biāo)記技術(shù)，與檢測樣品進(jìn)行雜交后，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)相關(guān)軟件對雜交結(jié)果進(jìn)一步分析，目前已用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等眾多檢測與診斷領(lǐng)域，對于靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)、藥物作用機(jī)理、藥物活性及毒性評價都具有天然的優(yōu)越性[7]。以計(jì)算機(jī)為核心的篩選技術(shù)是建立在復(fù)雜的數(shù)學(xué)算法、巨大的數(shù)據(jù)庫構(gòu)建和強(qiáng)大的系統(tǒng)搜索基礎(chǔ)之上，對中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究與分析的一種虛擬篩選技術(shù)[6]。上述篩選技術(shù)由于具有自動化程度高、通量高、誤差小和周期短等特點(diǎn)，已受到相關(guān)學(xué)者的廣泛關(guān)注，但仍面臨一些不足，如生物色譜法最為廣泛的應(yīng)用是將人血清白蛋白等運(yùn)載蛋白固定于大孔硅膠表面，用于藥物與蛋白相互作用研究或中藥活性成分篩選，但運(yùn)載蛋白并非中藥活性成分在體內(nèi)的靶蛋白，結(jié)合特異性較差；賀浪沖教授課題組[9-12]提出細(xì)胞膜色譜法，將高表達(dá)受體的細(xì)胞膜固載于色譜填料表面制備了系列細(xì)胞膜色譜固定相，并用其篩選了川芎、大黃、葛根等中藥的活性成分，但細(xì)胞膜中其他成分帶來的非特異性吸附問題無法避免；生物芯片技術(shù)在對單一成分的靶標(biāo)確證和活性預(yù)測方面具有極大優(yōu)勢，但難以應(yīng)用于復(fù)雜的混合體系中[7]；計(jì)算機(jī)輔助篩選雖然能大大減少新藥創(chuàng)制的盲目性和偶然性，降低研發(fā)成本，縮短研發(fā)周期，但其結(jié)果均為基于各種力場的預(yù)測性結(jié)果，仍需大量實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行驗(yàn)證[6]。

親和萃取法是近年來新興的一種活性成分篩選技術(shù)，該方法將生物大分子如功能蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸等固載于固體基質(zhì)表面，利用活性成分與生物大分子的親和作用將其從復(fù)雜樣品中捕獲，通過離心、超濾等方法達(dá)到活性成分與非活性成分的快速分離，最后利用高效液相色譜、質(zhì)譜和核磁共振等手段對活性成分進(jìn)行鑒定[13，14]。本文以G 蛋白偶聯(lián)受體成員之一的β2-腎上腺素受體（β2-AR）為例，制備了親和萃取材料（Affinity extraction material，AEM），篩選了延胡索水提液中的活性成分，采用高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（High performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole-time of flight-mass spectra，HPLC-ESI-Q-Tof-MS）鑒定生物堿類成分四氫非洲防己堿、紫堇堿和四氫小檗堿。該方法具有快速和簡便的特點(diǎn)，為中藥活性成分高效快速篩選提供了思路。

1 材料

1.1 儀器

KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；德國Eppendorf 5810R 型高速冷凍離心機(jī) ；1200 系 列 HPLC 串 聯(lián) 6520 系 列 ESI-Q-TOF-MS/MS（美國安捷倫科技公司）。

1.2 試劑及耗材

大孔硅膠（6 μm，300 A）購自蘭州化學(xué)物理研究所；延胡索藥材購自北京同仁堂西安大藥房有限公司，經(jīng)陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科鑒定為罌粟科（Papaveraceae）荷包丹亞科紫堇屬植物延胡索（Corydalis yanhusuoW.T. Wang）；甲醇（色譜純，美國Fisher 公司）；純凈水；沙丁胺醇和特步他林購自中國藥品生物制品鑒定所；其他試劑均為分析純。

1.3 試液

1.3.1 延胡索提取液

取干燥的延胡索藥材粉末0.5 g（過40目篩），加入10 mL 水，超聲提取3 次（40 kHz，每次30 min），收集濾液，減壓濃縮，蒸餾水定容至50.0 mL，0.45 μm 微孔濾膜濾過，-20℃冷凍備用。

1.3.2 對照品溶液

配置沙丁胺醇和特步他林水溶液對照品，沙丁胺醇和特步他林系列濃度均為1、5、10、20、40、80、160和200 μg·mL-1。

2 方法

2.1 親和萃取材料制備

采用文獻(xiàn)[3]方法制備β2-AR 親和萃取材料（β2-AR-AEM）。取大孔硅膠2.0 g，在甲醇-鹽酸（v∶v=1∶1）和98%的濃H2SO4溶液中各震蕩30 min，過濾，干燥乙腈洗滌多次。將洗滌后的硅膠加入至50 mL對氨基苯基三甲氧基硅烷/乙腈溶液中（40 μmol·mL-1），機(jī)械攪拌下室溫反應(yīng)6 h，過濾，干燥乙腈和水洗滌多次。將硅膠加入至30 mL 80 mmol·L-1HCl 溶液中，滴加新配置的40 mmol·L-1NaNO2溶液，碘化鉀試紙檢測反應(yīng)終點(diǎn)（變藍(lán)）。將純化的β2-AR溶液（純度為95%，10 mL，0.2 mg·mL-1）加入至上述重氮化硅膠中，4℃攪拌反應(yīng)1 h，抽濾，30 mM 乙酸銨洗滌多次，即得β2-AR-AEM。

2.2 親和萃取材料表征

2.2.1 特異性表征

取β2-AR-AEM，裸硅膠和重氮化硅膠各50 mg，加入100 μL 5.0 μg·mL-1特步他林，震蕩2 min，離心，收集上清。3種硅膠分別用純水洗滌2次（每次1.0 mL）后，加入100 μL 甲醇，離心后收集上清液，HPLC 檢測特步他林濃度。

2.2.2 親和萃取表征

稱取8 份 50 mgβ2-AR-AEM，離心，去上清，每份加入100 μL 不同濃度的特步他林溶液（1、5、10、20、40、80、160 和200 μg·mL-1），震蕩2 min，離心，收集上清。沉淀β2-AR-AEM 用純水洗滌2 次（每次1.0 mL），加入競爭劑沙丁胺醇（5.0 μg·mL-1），5000 r·min-1離心1 min，收集上清液，HPLC 檢測特步他林與沙丁胺醇濃度。

HPLC 條件：色譜柱：Agilent C8（5 μm，4.6 × 150 mm）；流動相：10%甲醇/0.01%甲酸水；流速：0.6 mL·min-1；紫外波長：276 nm。

2.3 延胡索水提液全成分分析

HPLC 條件：色譜柱：Agilent TC-C1（85 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：甲醇/水（A/B），兩相含5 mmol·L-1氨水，甲酸調(diào)節(jié)pH = 4.0；梯度洗脫條件為：0 - 15 min，50% 75% B；15.01 min，90% B。流速0.6 mL·min-1，三通分流，1/3 進(jìn)質(zhì)譜；柱溫25℃；延胡索提取液進(jìn)樣體積為5.0 μL。

MS 條件：電噴霧電離；正離子模式；干燥氣流量：10 L·min-1；干燥氣溫度：350℃；霧化氣壓力：45 psi；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；掃描范圍：m/z50-1000。

2.4 延胡索親和萃取及活性成分鑒定

延胡索親和萃取步驟同2.2.2項(xiàng)下親和萃取表征，即50 mgβ2-AR-AEM 中加入100 μL延胡索水提液，洗滌離心后，加入競爭劑沙丁胺醇（5.0 μg·mL-1），HPLC-ESI-Q-TOF-MS 檢測競爭所得活性成分，條件同2.3項(xiàng)下內(nèi)容。

3 結(jié)果

3.1 親和萃取材料表征

通過 HPLC 測定50 mgβ2-AR-AEM，裸硅膠和重氮化硅膠對特步他林的吸附量分別為（112 ± 10）ng，（13 ± 2）ng 和（9 ± 1）ng，表明裸硅膠與重氮化硅膠對特步他林為非特異性吸附，遠(yuǎn)小于β2-AR-AEM，提示β2-AR-AEM對受體工具藥具有特異性。

沙丁胺醇與特步他林均為β2-AR 激動劑，可競爭性結(jié)合于受體上同一類位點(diǎn)。以沙丁胺醇為競爭劑，測定解離的特步他林的量（表1）。由表可見，沙丁胺醇存在下，特步他林解離量隨特步他林原濃度的增加而增大。當(dāng)特步他林原濃度濃度＜20 μg·mL-1，其解離量與原濃度基本呈線性關(guān)系；當(dāng)濃度為40-80 μg·mL-1，解離量與原濃度呈非線性關(guān)系；當(dāng)濃度＞160 μg·mL-1，解離量基本達(dá)到飽和。

依據(jù)單位點(diǎn)特異性公式Y(jié)=（Bmax*X）/（Kd+X），利用軟件GraphPad Prism 5對表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得解離的特步他林與原溶液濃度的擬合圖（圖1），其中Bmax為飽和吸附量，即（2976 ± 39）ng，Kd為平衡常數(shù)，即（38.04 ± 1.52）μg·mL-1，相關(guān)系數(shù)R2為0.9969。提示，特步他林在β2-AR-AEM 上的吸附行為屬于單位點(diǎn)吸附，該過程可用朗格繆爾吸附模型描述。文獻(xiàn)[13]采用受體色譜法和放射性免疫法均研究了特步他林與β2-AR 的相互作用，明確指出特步他林在受體上只存在一類結(jié)合位點(diǎn)。與本研究結(jié)果一致，表明特異性配體競爭法可用于與β2-AR結(jié)合的活性成分篩選。

表1 沙丁胺醇存在下特步他林的解離量

圖1 特步他林原濃度與解離量關(guān)系

3.2 延胡索全成分分析

文獻(xiàn)[15-18]研究表明，延胡索主要成分為生物堿類，已鑒定生物堿共有30余種。本研究中，依據(jù)延胡索水提液中各成分保留時間、碎片離子和分子式信息，結(jié)合文獻(xiàn)[15-18]報導(dǎo)結(jié)果，共鑒定了延胡索水提液中的19種成分，包括13 種生物堿（d-異波爾定、異紫堇定、α-別隱品堿、四氫非洲防己堿、普魯托品、黃連堿、非洲防己堿、巴馬汀、四氫小檗堿、紫堇堿、延胡索乙素、小檗堿和二氫血根堿）、2 種有機(jī)酸（2-哌啶甲酸和山崳酸）、2 種甾體（胡蘿卜苷和豆甾醇）、1 種蒽醌（大黃素甲醚）和1種核苷類（腺苷）成分（圖2、表2）。李峰武[15]采用HPLC-ESI-Q-Tof-MS 法對延胡索提取液進(jìn)行了全成分分析，解析出延胡索中28 種化合物，包含18 種生物堿、4 種有機(jī)酸、3 種甾體、2 種蒽醌和 1 種核苷。本研究鑒定化合物數(shù)目少于文獻(xiàn)結(jié)果，可能原因在于提取方法不同：文獻(xiàn)采用超聲水提、氯仿萃取和甲醇重懸的方式制備延胡索供試品，其中含極性和非極性成分；本研究僅通過超聲水提和減壓蒸餾獲得供試品，多數(shù)為極性成分，非極性成分存在部分丟失。

圖2 延胡索水提液總離子流圖

表2 延胡索水提液質(zhì)譜鑒定結(jié)果（正離子模式）

3.3 延胡索活性成分篩選及鑒定

《本草綱目》《黃漢醫(yī)學(xué)》等古醫(yī)著作中均有記載，延胡索對支氣管病變、下呼吸道感染和結(jié)核性胸膜炎等疾病引起的頑固性咳嗽具有明顯療效[19]。β2-AR 主要分布于支氣管平滑肌，是止咳平喘類藥物作用的主要靶點(diǎn)，推斷延胡索中含有與該受體結(jié)合的活性成分。本研究采用β2-AR-AEM 篩選延胡索水提液中的活性成分，以沙丁胺醇為競爭劑，通過競爭法獲得與β2-AR結(jié)合的活性成分為4種（圖3）。HPLC/MS法獲得4 種成分質(zhì)荷比分別為 342.1826，340.2865，370.2342和356.1766，提示4 種成分分別為四氫非洲防己堿、四氫小檗堿、紫堇堿和延胡索乙素。

4 討論

本研究篩選的4種活性成分通過與沙丁胺醇競爭獲得，表明4 種物質(zhì)與沙丁胺醇競爭β2-AR 上的同一類位點(diǎn)。沙丁胺醇為β2-AR 最典型的激動劑之一，其羥基可與受體Ser204 和Ser207 以氫鍵結(jié)合，其苯環(huán)可與受體 Phe259 和 Phe290 發(fā)生 π-π 共軛[20，21]。本研究鑒定所得4 種成分均為四環(huán)芳香族化合物，具有相同的母核，推斷其均可以π-π 共軛方式與受體結(jié)合，激動β2-AR，因而可與沙丁胺醇發(fā)生競爭行為。劉昌孝院士團(tuán)隊(duì)[22]采用HPLC-QTOF/MS 研究了中藥延胡索的物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)延胡索提取物能激動多種G 蛋白偶聯(lián)受體，其中延胡索乙素能激動β2-AR。高小康等[23-24]采用定向固定化β2-AR色譜法篩選了延胡索提取液中的活性成分，發(fā)現(xiàn)提取液中四氫非洲防己堿、四氫小檗堿、紫堇堿和原阿片堿可與β2-AR 結(jié)合。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果高度一致，再一次證明β2-AR-AEM可用于篩選延胡索中與受體結(jié)合的活性成分。

圖3 延胡索活性成分鑒定

基于固定化受體的藥物活性成分篩選研究為中藥活性成分高通量篩選提供了方法學(xué)借鑒。趙新鋒教授課題組[25-26]在受體色譜藥物活性成分篩選方面做了大量工作，采用β2-AR 色譜法成功篩選了三子養(yǎng)親湯[27]、雙黃連[28]、紅景天[29]和羅漢果[30]等單味藥或復(fù)方中的活性成分。作為受體色譜工作的延續(xù)，其課題組孫珍鈺等[13]采用β2-AR-AEM 篩選了瀉白散中的活性成分為纈氨酸，4-羥基白藜蘆醇和地骨皮乙素。費(fèi)富歡等[14]將β2-AR 固載于Fe3O4磁性微球表面，用該親和材料篩選了中藥復(fù)方三拗湯中的活性成分。相比于受體色譜法，由于受體親和萃取法避免了制備色譜柱過程中高壓填充親和萃取材料的受體活性損失，在受體活性保持方面具有一定優(yōu)勢。該方法在篩選過程中，只需通過簡單的離心和清洗步驟就能將與受體結(jié)合和不結(jié)合的成分快速分離，具有操作簡單、快速和高效的特點(diǎn)，為中藥等復(fù)雜體系活性成分的高通量篩選提供了方法學(xué)借鑒。