CAD基因在泛癌中的預后評估作用

石新華

(新鄭市中醫院，河南 新鄭 451100)

嘧啶是核酸合成和DNA修復的重要組成部分。在增殖正常細胞和腫瘤細胞中，從頭進行嘧啶合成途徑的激活對于滿足DNA復制所需的核苷酸的高需求是至關重要的[1-2]。在動物體內，該途徑的前3個反應由CAD催化[3]。CAD是啟動和控制動物嘧啶從頭開始生物合成的多功能蛋白。CAD的上調對細胞增殖至關重要。因此，CAD有可能被用作抗腫瘤靶標。最近的研究表明靶向CAD基因可以改善膠質瘤患者的預后[4]。

鑒于腫瘤發生的復雜性，對任何目標基因進行泛癌表達分析并評估其與臨床預后和潛在分子機制的相關性非常重要。我們的研究首次使用癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數據庫對CAD基因進行了泛癌分析，以探索CAD基因在不同組織中的表達以及在腫瘤臨床預后中的潛在分子機制。

1 資料與方法

1.1 數據的獲取與預處理從TCGA數據庫下載了33種腫瘤的轉錄組測序數據，同時下載了相應患者的臨床信息、腫瘤突變負擔和微衛星不穩定性的信息。33種腫瘤包括：腎上腺皮質癌(adrenocortical carcinoma，ACC)、膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)、乳腺浸潤癌(breast invasive carcinoma，BRCA)、宮頸鱗癌和腺癌(cervical and endocervical cancers, CESC)、膽管癌(cholangiocarcinoma, CHOL)、結腸癌(colon adenocarcinoma, COAD)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma, DLBC)、食管癌(esophageal carcinoma, ESCA)、多形成性膠質細胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)、頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma ,HNSC)、腎嫌色細胞癌(kidney chromophobe ,KICH)、腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma ,KIRC)、腎乳頭狀細胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma ,KIRP)、急性髓細胞樣白血病(acute myeloid leukemia ,LAML)、腦低級別膠質瘤(brain lower grade glioma, LGG)、肝細胞肝癌(liver hepatocellular carcinoma, LIHC)、肺腺癌(lung adenocarcinoma ,LUAD)、肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma ,LUSC)、間皮瘤(mesothelioma ,MESO)、卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma ,OV)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma ,PAAD)、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(pheochromocytoma and paraganglioma ,PCPG)、前列腺癌(prostate adenocarcinoma ,PRAD)、直腸腺癌(rectum adenocarcinoma ,READ)、肉瘤(sarcoma ,SARC)、皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma ,SKCM)、胃癌(stomach adenocarcinoma ,STAD)、睪丸癌(testicular germ cell tumors ,TGCT)、甲狀腺癌(thyroid carcinoma ,THCA)、胸腺癌(thymoma ,THYM)、子宮內膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma ,UCEC)、子宮肉瘤(uterine carcinosarcoma, UCS)、葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma ,UVM)。

1.2 預后評估與統計學處理采用R軟件進行統計學分析。用Cox回歸分析評估每種腫瘤類型的CAD基因表達與患者總生存期、疾病特異性生存期和疾病無進展生存期之間的相關性。根據CAD基因表達的中位值，將患者分為CAD高表達組與CAD低表達組，使用Kaplan -Meier方法繪制每種腫瘤類型的患者生存曲線，使用log-rank檢驗分析生存狀況。使用的“ESTIMATE”軟件包計算每例患者的基質評分和免疫評分來評估患者的腫瘤微環境[5]。使用“CIBERSORT”算法計算每例患者22種免疫細胞浸潤情況[6]。使用Spearman相關評估CAD基因表達與靶標間的相關性(基質評分，免疫評分，免疫細胞浸潤，腫瘤突變負荷，微衛星不穩定)。使用t檢驗評估腫瘤與正常組織之間的CAD基因表達水平。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各種正常組織和腫瘤組織中的CAD表達水平在TCGA數據庫中共有24種腫瘤存在相應的正常組織作為對照。在這24種腫瘤中有19種腫瘤的CAD基因表達與正常組織比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，KICH中的CAD基因表達低于對應的正常組織，其余18種腫瘤中的CAD基因表達均高于對應的正常組織。見圖1。

圖1 33種腫瘤及其相應正常組織中CAD基因表達的箱圖[1)P<0.05]

2.2 CAD基因表達水平與預后之間的關系CAD基因表達是ACC、BLCA、COAD、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、MESO、SARC、SKCM、UCEC的危險因素，而CAD基因表達是READ的保護因素(P均<0.05)。進一步根據CAD基因表達的中位值將33種腫瘤患者分為CAD高表達組與CAD低表達組后進行生存分析發現，在ACC、KIRC、LGG、LIHC、MESO、SARC、UCEC患者中，CAD高表達組患者與CAD低表達組患者間的總體生存期比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。比較一致的是，CAD高表達組患者的總體生存期均小于CAD低表達組(P均<0.05)?？紤]到總體生存期可能會受到非腫瘤死亡的影響，我們進一步評估了CAD基因表達與疾病特異生存間的關系。相似的是，CAD基因表達是ACC、BLCA、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、MESO、PCPG、PRAD、SARC、SKCM、THCA的危險因素。在GBMLGG、KIRC、LIHC、MESO、PRAD、UCEC、UVM患者中,CAD高表達患者疾病特異生存期減少(P均<0.05)。CAD基因表達與疾病無進展生存期的關系研究結果顯示，CAD基因表達是ACC、BLCA、KIRC、腦LGG、LIHC、MESO、PAAD、PCPG、PARD、SARC、UCEC、UVM的危險因素。根據CAD基因表達的中位值將患者分為2組，在ACC、GBMLGG、LIHC、MESO、PCPG、PRAD、UCEC、UVM患者中，CAD高表達組疾病無進展生存期較CAD低表達組。見圖2～4。

圖2 33種腫瘤中CAD基因表達與總體生存期關系的森林圖(X軸刻度線遵循對數刻度)

圖3 33種腫瘤中CAD基因表達與疾病特異生存期關系的森林圖(X軸刻度線遵循對數刻度)

圖4 33種腫瘤種CAD基因表達與疾病無進展生存期關系的森林圖

2.3 CAD基因表達與腫瘤微環境間的關系CAD表達與一些腫瘤的基質評分、免疫評分密切相關。在11種腫瘤中CAD基因表達與基質評分呈負相關，其中LAML、SARC、TGCT最顯著(r=-0.42、-0.42、-0.47，P均<0.05)。在14種腫瘤中CAD基因表達與免疫評分呈負相關，其中LAML、OV、SARC最顯著(r=-0.39、-0.38、-0.33，P均<0.05)。在11種腫瘤中CAD基因表達與M0巨噬細胞的浸潤呈正相關，其中LIHC、SARC、SKCM最顯著(r=0.24、0.24、0.21，P均<0.05)。

2.4 CAD基因表達與腫瘤突變負荷和微衛星不穩定間的關系33種腫瘤中，ACC、BRCA、HNSC、KICH、KIRC、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、SKCM、STAD等12種腫瘤的CAD基因表達與腫瘤突變負荷均存在顯著正相關關系，其中ACC、KICH、LUAD的相關系數最高。33種腫瘤中，BLCA、CESC、COAD、DLBC、ESCA、GBM、KICH、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、OV、READ、UVM等14種腫瘤的CAD基因表達與微衛星不穩定存在顯著相關性，DLBC、COAD、READ中CAD基因與微衛星不穩定呈負相關，而剩余11種腫瘤中CAD基因表達與微衛星不穩定呈正相關，其中KICH、LUSC、UVM的相關系數最高。見圖5。

圖5 CAD基因表達與腫瘤突變負荷(A)和微衛星不穩定(B)的關系[1)P<0.05]

3 討論

本文結果顯示，CAD基因在多種腫瘤組織中表達增高，并且這種高表達與這些腫瘤較差的總體生存期和疾病特異性生存期有關。例外的是，當將CAD基因視為連續性變量時，CAD基因表達是COAD的保護因素。此外，部分患者中CAD基因表達與疾病進展相關，其中CAD基因高表達患者腫瘤復發較早。因此，需要加強對這些患者的護理與隨訪。識別出高?；颊?，制定個性化治療方案，加強對這部分患者的護理與隨訪將有希望改善其預后。CAD是啟動和控制動物嘧啶從頭開始生物合成的多功能蛋白。嘧啶是核酸合成和DNA修復的重要組成部分。在增殖正常細胞和腫瘤細胞中，從頭進行嘧啶合成途徑的激活對于滿足DNA復制所需核苷酸的高需求是至關重要的。盡管先前有研究證實了CAD基因表達與LIHC、LUAD、PRAD等腫瘤的不良預后有關，但尚未有基于泛癌數據的研究[7-9]。我們的研究發現了CAD基因表達與各種腫瘤之間的相關性，包括與腫瘤生存和預后的明確聯系，使其成為用于腫瘤監測和進一步研究的生物標志物。

浸潤的基質細胞和免疫細胞構成腫瘤組織中正常細胞的主要部分，在腫瘤生物學中起著重要作用。我們使用“ESTIMATE”算法評估了33種腫瘤患者的基質評分和免疫評分，并探索了CAD基因表達與兩者的關系。我們的相關分析的結果顯示，在大部分腫瘤中，CAD基因表達與基質評分、免疫評分呈負相關。即CAD基因高表達患者基質評分、免疫評分較低。此外，先前的研究表明，在大部分腫瘤中，高基質評分、免疫評分與低腫瘤純度相關和良好的預后相關，這與我們的結果一致[10-12]。另外，我們通過“CIBERSORT”評估患者的免疫細胞浸潤情況，并探索CAD基因表達與免疫細胞浸潤間的關系。結果顯示，在許多腫瘤中CAD基因表達與M0巨噬細胞浸潤呈正相關。一致的是，最近的研究表明巨噬細胞浸潤通常與免疫抑制性微環境有關。此外，研究[13-15]表明高M0巨噬細胞浸潤與多種腫瘤的不良預后相關。總之，CAD基因表達與多種腫瘤的腫瘤微環境密切相關。盡管先前的研究[2]表明，嘧啶合成對于T淋巴細胞增殖至關重用。遺憾的是，CAD基因影響腫瘤微環境的確切機制尚未確定，因此需要進一步探究CAD基因影響腫瘤微環境的機制。

我們還研究了CAD基因表達與腫瘤突變負荷和微衛星不穩定間的關系。如今已證實腫瘤突變負荷和微衛星不穩定可以預測患者的多種藥物反應，特別是免疫檢查點抑制劑類藥物[16-18]。研究[19-21]表明，高腫瘤突變負荷、微衛星不穩定與良好的免疫檢查點抑制劑藥物反應相關。而我們的結果顯示，在KIRC、LUAD、LUSC等腫瘤中CAD基因表達與腫瘤突變負荷和微衛星不穩定呈正相關。這提示CAD基因表達可能是潛在的藥物反應指標，需要進一步的研究來證明這一結果。

盡管我們的研究提供了CAD基因參與腫瘤發生和腫瘤細胞免疫環境調節的有用信息，但其確實存在一些局限性。首先，作為一種純粹的生物信息學分析，其完全依賴于開放存取數據庫中可用的信息，而沒有通過實驗進行確認。在我們的研究中，CAD基因表達的評估完全基于上述數據庫，即使這可能無法反映功能蛋白的水平。例如，轉錄后修飾和(或)調節的蛋白水解作用可能在正常細胞或腫瘤細胞中影響蛋白質活性。未來的研究將側重于通過實驗驗證我們的數據，并探索CAD基因在腫瘤發生中的可能機制。其次，CAD基因影響腫瘤微環境的途徑尚未知，需要可靠實驗證明CAD基因與腫瘤免疫微環境間的聯系。

我們的結果表明，CAD基因與多種腫瘤的發生、發展密切相關。在多種腫瘤中CAD基因高表達患者預后差。因此，對于CAD基因高表達患者應加強護理與隨訪。CAD基因表達與腫瘤微環境有密切聯系。