益氣化瘀解毒方聯合索拉非尼對人肝癌索拉非尼耐藥細胞移植瘤及缺氧誘導因子1α與血管擬態表達的影響*

王亞琪，曾普華，郜文輝△

1.湖南中醫藥大學(長沙 410208)；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院腫瘤中心(長沙 410006)

原發性肝癌具有起病隱匿、惡性程度高、疾病進展快、預后較差、死亡率高等特點。我國肝癌發病率位居全球首位，其發病人數和死亡人數均占全球半數以上。目前肝癌以手術、介入、分子靶向治療為主，存在高復發和轉移率、治療缺乏針對性、難治性耐藥和源頭創新藥物少等問題[1-2]。

肝癌患者對靶向藥物Sorafenib的快速耐藥是導致臨床分子靶向治療失敗的主要原因之一。目前實驗研究表明[3-5]，Sorafenib抗血管新生可加重局腫瘤微環境乏氧狀態，刺激HIF-1α的表達，腫瘤細胞在缺氧環境下可能通過變形、遷移，重新粘附，形成血管樣結構，通過血管擬態(VM)獲取血液供應，從而產生耐藥性。目前西醫對其耐藥問題尚無行之有效的治療方法，而傳統中醫藥具有“多層次、多環節、多靶點”的作用[6]，尋求逆轉Sorafenib耐藥的方藥可望帶來新突破。故本實驗主要分析HIF-1α及VM的表達與耐藥的關系，探討益氣化瘀解毒方聯合Sorafenib對逆轉人肝癌細胞Sorafenib耐藥的作用及可能機制。

材料與方法

1 材 料 人肝癌QGY7702細胞和人肝癌QGY7702/Sora細胞均由上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝病研究所劉祖龍博士惠贈。實驗動物：BALB/c-nu裸鼠，雄性，4～5周齡，70只，SPF級，購于長沙斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK(湘)2014-0012。索拉非尼(南通飛宇生物科技有限公司，規格：200 mg，批號：FY34720409)。益氣化瘀解毒方(白參10 g，黃芪30 g，醋莪術、重樓各15 g，半枝蓮30 g，甘草5 g等)飲片購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院。高糖DMEM培養基、PBS緩沖液(Hyclone);胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗溶液(Gibco)。Anti-HIF-1α(HIF1A)Antibody(博士德)，Anti-CD31 Rabbit pAb(Sevicebio),通用二步法檢測試劑盒(中杉金橋)。

2 藥物制備 Sorafenib稀釋液配制：索拉非尼200 mg用100 ml生理鹽水充分混勻，稀釋濃度為2 mg/ml，置于4℃備用。中藥的煎煮：按比例配置好藥材，加入適量冷水浸泡30 min，文火煎煮，第一道10倍水煎煮2 h，第二道8倍水煎煮1 h，兩道混合過濾、離心去渣，再將藥物濃縮至含1 g生藥/ml，置于4 ℃備用。

3 腫瘤細胞的培養 將人肝癌細胞株QGY7702和耐藥株QGY7702/Sorafenib接種于10% 胎牛血清+90% DMEM+1%青/鏈霉素雙抗溶液的完全培養基中，置于37 ℃，5%CO2的培養箱內。當細胞鋪滿85%左右時用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。耐藥細胞培養至約合120個T25瓶(每瓶長滿約5×106個細胞)，非耐藥細胞約20個T25瓶數量以上，胰酶消化，2000 r/min,5 min離心，收集細胞，用PBS緩沖液稀釋細胞濃度至約1×107個/0.2 ml。

4 動物造模、分組、給藥 將收集的細胞接種至裸鼠的臀背部皮下，每只接種0.2 ml(約含1×107個細胞)，接種1周后，65只裸鼠臀背部接種處均形成一黃豆大小隆起。除完全空白對照組親本細胞模型7只外，其余耐藥模型隨機分為6組，模型組10只，益氣化瘀解毒方組9只，重樓組10只，順鉑組10只，Sorafenib組10只，中西聯合(益氣化瘀解毒方+Sorafenib)組9只。成瘤后5 d/次監測裸鼠的體重變化并記錄。根據人臨床給藥劑量倍數換算法折算動物給藥總劑量。益氣化瘀解毒方組裸鼠灌胃總藥量為15 g/kg，1次/d；重樓組裸鼠灌胃總藥量為4.5 g/kg，1次/d；Sorafenib組裸鼠灌胃總藥量為30 mg/kg，1次/d；順鉑組裸鼠腹腔注射總藥量為25 mg/kg，1次/5d；中西聯合組藥物用中藥和Sorafenib各半灌胃，1次/d；空白組給予生理鹽水灌胃，1次/d。根據裸鼠體重計算灌胃劑量，連續用藥21 d后取瘤稱重，部分組織用4%多聚甲醛固定，部分存放于液氮中。

5 免疫組化法檢測瘤組織HIF-1α表達 瘤組織常規石蠟包埋，切片。脫蠟后入水，滴加抗原修復液、正常山羊血清封閉液、一抗、二抗，經 DAB 顯色，蘇木素復染細胞核，水洗，脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。拍照，進行圖象分析。HIF-1α表達的判定：HIF-1α主要表達在細胞核，陽性染色為棕黃/褐色顆粒。低倍鏡下(×100)確定5個陽性著色密集區域，在高倍鏡(×400)視野下拍照，計數陽性細胞數，取5個視野的均值。

6 CD31/PAS雙重染色 石蠟切片常規脫蠟水化后，按照SP法操作，進行CD31免疫組化染色，DBA染色至血管內皮細胞著色后，終止反應，過碘酸溶液中氧化，再行PAS染色，最后用蘇木素復染細胞核，脫水，透明，中性樹膠封片。拍照，進行圖象分析。VM表達的判定：CD31為內皮細胞標記分子，陽性定位于細胞膜。PAS 能夠把血管周圍富含糖原的基底膜結構染成紫紅色。內皮細胞標記的血管為 CD31/PAS 雙陽性，而VM是由腫瘤細胞圍成的血液流通的管道，基底膜在周圍包圍，CD31 陰性而 PAS 陽性，并且管腔內可觀察到紅細胞。低倍鏡下(×200)確定5個陽性著色密集區域，在高倍鏡(×400)視野下拍照，計數血管擬態，取5個視野的均值。

結 果

1 各組移植瘤凈重的比較 見表1。從各組瘤凈重比較來看，耐藥細胞模型組瘤普遍比不耐藥細胞空白組小，差別具有統計學意義(P<0.01)。益氣化瘀解毒方聯合Sorafenib組與模型組相比差別，瘤體重量明顯減輕，差別具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組瘤凈重比較(g)

注：與模型組比較，*P<0.05；模型組與空白對照組比較,△P<0.01

2 各組瘤組織中HIF-1α表達水平 見表2。模型組瘤組織中HIF-1α表達水平高于空白對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)；益氣化瘀解毒方組及中西聯合組與模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)，兩組均可抑制HIF-1α表達(圖1)。

3 各組瘤組織中VM表達水平 見表2。Sorafenib組瘤組織中VM表達水平明顯高于模型組的表達水平(P<0.05)；中西聯合組與Sorafenib組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)，可抑制VM表達水平(圖2)。

圖1 各組瘤組織HIF-1α表達(免疫組化法，×400)

圖2 各組瘤組織VM表達(CD31/PAS染色，×400)

表2 各組瘤組織HIF-1α及VM表達水平比較(個/視野)

注：與模型組比較，*P<0.05，△P<0.01；與Sorafenib組比較，

#P<0.05，◇P<0.01

3 HIF-1α與VM表達水平的相關性 HIF-1α在瘤組織中的表達水平為(51.21±7.77)個/視野，VM在瘤組織中的表達水平為(8.17±1.50)個/視野。兩者之間存在相關性，呈正相關，相關系數為r=0.609>0.4，可認為兩者之間存在中度相關(圖3)。

圖3 HIF-1α與VM相關關系散點圖及相關系數

討 論

原發性肝癌惡性程度高、預后差，而作為一線治療藥物的分子靶向藥物Sorafenib因臨床快速獲得性耐藥問題導致客觀有效率較差。因此，本實驗主要深入探討益氣化瘀解毒方聯合Sorafenib對耐藥模型干預的影響，以明確其作用及作用機制，對于改善肝癌治療及預后具有重要意義。

肝癌耐藥在中醫并確切的稱謂，但根據其臨床表現，可屬中醫“肝積”、“積聚”、“脅痛”、“肝脹”、“黃疸”、“虛勞”等相關病癥。中醫古籍對肝癌相關病癥的病因病機論述眾多。肝癌病情復雜、惡性程度高、侵襲性強、進展快、預后極差、多伴有肝病背景、多種邪毒和病理因素夾雜等，這些可歸屬于中醫“毒”或“癌毒”的范疇；肝癌為有形之積，肝腫塊常伴疼痛、舌質暗紅或瘀斑是“瘀”的客觀表現；肝癌患者常見腹脹、納差、神疲、乏力伴進行性消瘦等為“脾虛”之癥；癌毒、瘀血、脾虛三者始終并存，互為因果，惡性循環，貫穿于肝癌整個病程。“堅者軟之”,“衰者補之”，治療當攻補兼施，故“益氣化瘀解毒”是切合肝癌病機的常用治法[7-8]。

“益氣化瘀解毒方”是經病證結合、精準配伍而成的臨床應用多年的效驗方。全方以白參、黃芪益氣健脾；莪術行氣化瘀散結；重樓、半枝蓮清熱解毒，全方藥物配伍精要，扶正抗癌，標本兼治。該組方藥物富含人參皂甙、重樓皂苷、多糖、莪術醇、姜黃素、糖蛋白等[9-11]多種抗腫瘤活性組分，既往臨床研究證實具有穩定瘤體、調節免疫、改善生活質量、抗復發轉移而使患者呈現“帶瘤生存”的特點。課題組前期基于對“益氣化瘀解毒方”的“多活性組分配伍、多環節、多靶點”抗肝癌作用研究[12-14]，提示該方能抑制人肝癌Hep G2細胞和裸鼠移植瘤的生長，能下調HIF-1α、VEGF等表達，上調E-cad表達，抑制肝癌血管新生及血管生成擬態、EMT的形成，對腫瘤血管微環境具調節作用。

目前多數研究證實[5]，實體腫瘤普遍存在缺氧的現象，HIF-1α是腫瘤細胞缺氧調節基因表達的調控中心，在低氧環境中為腫瘤細胞提供空間和營養物質。HIF-1α是缺氧誘導因子信號調節通路的中心環節,是一種氧分壓感受器,在有氧環境中受各種酶調控可被降解;缺氧時,蛋白酶體系不能泛素化使HIF-1α不能被降解而在細胞體內大量蓄積,蓄積的HIF-1α使癌細胞更適應低氧環境,為癌細胞的增殖、遷移及耐藥提供有利條件。血管擬態(VM)[15]是一種不同于經典的完全不依賴于內皮細胞的血管生成模式，腫瘤細胞模擬內皮血管生成途徑形成網狀管道樣結構，輸送血液的微循環管道。VM的形成為腫瘤的增殖、遷移和侵襲，甚至耐藥的產生提供良好的營養環境。同時，科學實驗已證實[3，5]，缺氧微環境中HIF-1α的過表達是調控VM形成的重要因素。

本實驗結果提示，HIF-1α與VM的表達有中度相關性，呈正相關。耐藥模型組與不耐藥空白對照組比較，HIF-1α與VM表達均有高表達，說明耐藥現象的發生與機體HIF-1α與VM的過表達相關。益氣化瘀解毒方聯合Sorafenib干預后，可明顯抑制人肝癌Sorafenib耐藥細胞裸鼠移植瘤瘤體生長，使瘤組織的HIF-1α與VM表達明顯下降，說明益氣化瘀解毒方聯合Sorafeinb在基于抗腫瘤作用上亦可改善腫瘤組織乏氧微環境狀態，抑制血管擬態的形成，提高機體對Sorafenib的敏感性，從而拮抗Sorafenib耐藥的產生。

綜上，益氣化瘀解毒方聯合Sorafenib基于抗腫瘤作用亦可抑制HIF-1α與VM的表達，改善瘤組織乏氧微環境狀態，拮抗機體Sorafenib耐藥。目前多數研究亦表明，耐藥的發生與腫瘤細胞間質化的轉變、腫瘤干細胞、炎性微環境、外泌體及基因調控等方面密切相關，拮抗耐藥應從多角度多層次考慮，對于益氣化瘀解毒方的挖掘亦有待進一步深入。