滌痰湯改善卒中后抑郁大鼠抑郁癥狀及對腦腸肽的調節作用*

張卓然，周雅然，王甲偉

1.陜西省中醫醫院(西安 710003)；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院(天津 300193)；3.江蘇省常州全心堂中醫門診部(常州 213001)

卒中后抑郁(Post-stroke depression,PSD)是指在腦卒中后所出現的由多種復雜因素引起的情感障礙性疾病。研究發現，卒中后抑郁患者的死亡率是卒中后未患抑郁人群的3.4倍，國外發病率為25%～79%，國內為31.2%～63.1%，從大量的臨床報道中可見PSD發病率主要集中在30%～50%[1-4]，并呈逐年上升趨勢。研究顯示中藥方劑滌痰湯可能通過神經元重塑、緩解氧化應激反應、激活腦組織蛋白激酶、減少自噬凋亡水平等多種途徑改善腦功能[5-8]。最新研究發現腦-腸軸與心腦血管疾病關系密切，腦腸肽作為一類特殊的信息物質雙重分布在神經組織與胃腸道中，通過腦-腸軸對胃腸道功能進行調控，其作用復雜多樣而廣泛，參與調解機體內的多種生理功能。本實驗以PSD大鼠模型為研究對象，以中藥方劑滌痰湯為干預方法，觀察對PSD大鼠胃泌素(Gastrin,GAS)、神經肽Y(Neuropeptid-ey,NPY)、降鈣素基因相關肽(Calcitonin gene related peptide,CGRP)等受體表達的影響，為臨床治療PSD選穴提供實驗依據。

材料與方法

1 動物與分組 成年雄性SD大鼠80只(由空軍軍醫大學實驗動物中心提供，合格證編號[SCXK(軍)2012-0007]，體重(200±20) g。飼養于陜西中醫藥大學中心實驗室,動物飼養室溫度(18～25)℃，濕度(35±2)%，動物在自然光線下自由的進食和飲水并定期更換墊料，實驗中對動物的處理過程嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》相關倫理學規定。適應性飼養10 d后，按照隨機數字表法分為4組：空白組、模型組、西藥治療組、中藥治療組。

2 主要試劑與儀器 電子秤(陜西公平電子衡器有限公司)，Ultrafreeze 3410超低溫冰箱(日本三洋電機株式會社)，ZK-380型低溫高速離心機(Germany)，全自動酶標儀(美國Bio-Tek ELX808IU)，OPen-Field敞箱曠場(成都泰盟科技有限公司)，GAS/NPY/CGRP ELISA試劑盒(北京誠林生物科技有限公司)。

3 模型制備與鑒定 采用改良的Zea-Longa法制備大腦中動脈缺血大鼠模型(MCAO模型)[9-10]，MCAO模型制備：手術前大鼠禁食禁水24 h，腹腔注射8%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉,麻醉成功后仰臥位固定于操作臺,手術視野常規備皮消毒,沿頸正中縱切一條長約1.5～2.0 cm手術切口，鈍性分離切口下皮下組織,沿右側胸鎖乳突肌和頸前肌群之間分離右側頸總動(CCA)、頸外動脈(ECA) 和頸內動脈(ICA)，分離頸內動脈和頸外動脈分叉處的迷走神經。使用微動脈夾暫時夾閉CCA和ICA,并置一根絲線于ICA近心端，然后在CCA和ECA分叉3 mm處剪開一小口，將魚線插入ICA并輕推,如遇阻力即停，插入長度約為1.8 cm，結扎先前置于ICA的絲線,取掉微動脈夾。完成手術后逐層縫合并消毒，給予各組術后大鼠腹腔注射青霉素40000 U/d，共計3 d，以預防感染及電解質紊亂。造模成功后次日將模型大鼠單籠孤養，每日給予實驗鼠皮下注射利血平制備卒中后抑郁模型(PSD模型)，劑量為4 mg/kg，1次/d，共計16 d。

4 研究方法 卒中后抑郁模型造模完成3 d后，中藥治療組與西藥治療組開始治療。空白組與模型組大鼠僅給予相同抓取與鹽水灌胃，不做給藥處理。

中藥治療組給予滌痰湯灌胃治療，滌痰湯中各藥量分別為半夏10 g，茯苓、姜南星、石菖蒲各8 g，橘紅、枳實、竹茹、人參、甘草各6 g，飲片購自陜西省中醫院。煎煮方法為煎煮2次，一煎40 min，二煎30 min，兩次煎液混合并過濾后，放于4℃冰箱儲存備用。滌痰湯劑量折合成生藥量為8.55 g/kg，即滌痰湯原方煎制后濃縮至含生藥量 0.855 g/ml，上午9:00開始灌胃，1日1次，每次1 ml，共計治療28 d。

西藥治療組給予鹽酸氟西汀膠囊(國藥準字J20170022，20 mg/片)，根據“實驗動物與人按體表面積比等效劑量換算比率表”推算，西藥治療組大鼠給藥劑量為2 mg/kg，1日1次，治療天數與中藥組相同，共計28 d。

5 觀察指標及檢測方法 曠野實驗(OFT)：分別于造模后第2、14、28天進行曠野實驗。使用長寬各80 cm、高50 cm的敞箱，開放場區域為80 cm×80 cm，將其平均分為25個方格，周圍為黑色；檢測時間持續5 min，將大鼠迅速放于實驗箱底部的中心方格內,以大鼠穿越底面的格數為水平活動(Crossing)得分,以直立次數為垂直探究活動(Rearing)得分,然后記錄大鼠在5 min內活動情況。

糖水消耗實驗：分別于造模后第2、14、28天測定大鼠糖水消耗量。測定前大鼠禁食禁水24 h，給予1%糖水飲用，1 h后取水定量，比較各組大鼠糖水消耗量的差異。

HE染色：造模28 d后，每組選取5只大鼠，麻醉處死后快速斷頭取腦，冰上迅速取海馬組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定2周。石蠟包埋后震蕩切片，切片厚度為2.5 μm。將切片置于干燥箱中烘烤至完全蠟溶，繼而乙醇梯度脫水、滴加伊紅蘇木精染色、二甲苯透明、中性樹膠封片，成片后于光鏡下觀察組織結構的改變。

酶聯免疫吸附法檢測血清GAS、NPY、CGRP含量：造模28 d后，將大鼠麻醉后將其仰臥位固定于手術臺上，打開腹腔，抽取下腔靜脈血約5 ml注入離心管，室溫血液自然凝固10～20 min,離心機設置為2500 rcf/min離心15 min，收集血清放置于-70℃冰箱保存。嚴格按照ELISA試劑盒的操作說明檢測血清中GAS、NPY、CGRP的含量。用吸光度值與標準品的含量計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的吸光度值帶入方程式中，計算出樣品含量并乘以稀釋倍數，得出樣品實際含量。

結 果

1 各組大鼠的一般狀態比較 MCAO造模成功后，大鼠開始出現不同程度的肢體活動障礙，出現無法直立、活動轉圈等現象。PSD模型制備成功后，大鼠一般狀態發生明顯改變，包括易激惹、好斗、毛色晦暗、體毛脫落嚴重、活動度減少、精神萎靡倦怠、食欲下降、慢性腹瀉(稀便持續存在)、消瘦、置于籠外無明顯逃避反應等表現。各治療組大鼠一般狀態明顯較模型組更好，隨著治療天數的增加，各治療組大鼠對外界刺激的反應能力增強，日常活動較模型組活躍。

2 各組大鼠自發運動水平比較 PSD造模后第2天，與空白組相比，模型組、西藥治療組、中藥治療組大鼠運動均顯著減少(P<0.01)；PSD造模后第14天，西藥治療組與中藥治療組大鼠運動相較模型組有所增多，但差異無統計學意義(P>0.05)；PSD造模后第28天，西藥治療組與中藥治療組與模型組相比，運動均有明顯增多(P<0.01)；各治療組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。由此說明滌痰湯與鹽酸氟西汀膠囊均可顯著改善PSD大鼠自發行為活動，并且使用滌痰湯進行干預作用更佳，見表1、2。

表1 各組大鼠水平運動得分比較(分)

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

表2 各組大鼠垂直運動得分比較(分)

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3 各組大鼠糖水消耗比較 見表3。PSD造模后第2天，與空白組對比，模型組、西藥治療組、中藥治療組大鼠糖水消耗量均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；PSD造模后14 d，西藥治療組、中藥治療組大鼠糖水消耗量均高于模型組，但差異無統計學意義(P>0.05)；PSD造模后28 d，西藥治療組、中藥治療組大鼠糖水消耗量與模型組相比均有顯著的增加(P<0.01)；各治療組組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。由此說明滌痰湯與鹽酸氟西汀膠囊均可增加PSD大鼠的糖水消耗量，并且使用滌痰湯進行干預作用更佳。

表3 各組大鼠糖水消耗比較(ml)

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

4 各組大鼠腦組織皮層及海馬區病理損傷程度比較 空白組大鼠皮層及海馬區神經元結構正常數量豐富，細胞形態規則染色均一，胞質豐富清亮，細胞膜與核膜明顯，核仁清晰。模型組大鼠皮層及海馬區腦組織結構松散且神經元數量明顯減少，細胞染色淺且排列紊亂不對稱，細胞體積明顯縮小變形，細胞膜、核膜模糊不清晰，細胞核體呈固縮表現，可見壞死的神經元。西藥治療組與中藥治療組皮層及海馬區神經元細胞形態接近正常，細胞數量較模型組有所增加，胞核固縮及空泡化程度有所減輕(圖1)。

A.空白組海馬區；B.模型組海馬區；C.西藥治療組海馬區；D.中藥治療組海馬區；E.空白組皮層區；F.模型組皮層區；G.西藥治療組皮層區；H.中藥治療組皮層區

5 各組大鼠血清GAS、NPY、CGRP含量的比較與空白組相比較，模型組大鼠血清GAS含量明顯降低(P<0.01)；治療28 d后，西藥治療組、中藥治療組大鼠血清GAS含量與模型組比較有明顯增加(P<0.01)；與空白組相比較，模型組大鼠血清NPY含量明顯降低(P<0.01)；治療28 d后，中藥治療組大鼠血清NPY含量與模型組比較有明顯增加(P<0.01)，而西藥治療組血清NPY含量與模型組比較有所增加但差異無統計學意義(P>0.05)；與空白組相比較，模型組大鼠血清CGRP含量明顯降低(P<0.01)；治療28 d后，西藥治療組、中藥治療組大鼠血清CGRP含量與模型組比較明顯減少(P<0.01)。

表4 各組大鼠血清GAS、NPY、CGRP含量比較(ng/ml)

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

討 論

PSD屬于中醫“郁證”、“臟躁”范圍，病因多為年老體弱、肝腎陰虛、痰瘀阻竅等因素，并且其證候復雜，病程綿延。徐文玉等[11]認為本病多發病于氣血虛衰的中風恢復期，而痰瘀貫穿病程始末，多為虛實夾雜之證。徐容富等[12]發現中風病氣虛血瘀型與風痰阻絡型合并發作抑郁的可能性較高，表明PSD的發生與氣、血、痰、瘀關系密切。金越等[13]認為,卒中后患者多屬痰濕偏盛型,痰濕阻滯經絡，氣機不暢則易發郁證。由此可見PSD基本病機可歸納為氣血虛衰、痰瘀閉阻，神明失養，整體表現為虛實夾雜，故本病的治療原則首當豁痰開竅，扶正祛邪。滌痰湯源自清·《奇效良方》[14]，以半夏、橘紅、枳實、茯苓燥濕祛痰，理氣降逆；膽星、竹茹清熱化痰；人參、甘草、生姜、大棗益氣健脾，治痰之源；菖蒲化濕開竅。諸藥合用，滌痰開竅，諸藥合奏豁痰清熱，利氣補虛之功效，主治中風痰迷心竅，舌強不能言。滌痰湯成方以來至近代，加減應用廣泛，治證范圍遠遠超過《奇效良方》所載的治療范圍[15]，隨著朱丹溪從痰論治雜病的影響，其加減治療病證的擴展到治療郁證、癡呆、不孕、驚風、呃逆、反胃、等疾病。有研究表明，滌痰湯可抑制卒中后抑郁患者外周血中的NF-κB、miR-146a含量表達，繼而減輕腦組織炎癥反應[16]，另有研究顯示，滌痰湯通過上調突觸相關蛋白SYP、PSD95、NR2B表達，重啟神經元突觸微結構可塑性，從而改善痰濁證候表現[17]。

當今社會環境隨著人們的飲食結構和生活習慣的改變，肥甘厚膩及安逸久坐的生活方式成為常態，PSD的臨床表現也變得復雜多樣[18]。自1897年國外生理學家Cannon提出神經系統與胃腸運動聯系的觀點以來[19]，越來越多的研究發現腸-腦相關性并提出了腦-腸軸學說，即認為神經中樞與神經內分泌、腸神經系統和免疫系統之間存在雙向調節通路。該通路通過神經系統及某些肽類物質、細胞因子使得大腦與胃腸道間緊密相連，胃腸道傳入神經纖維接收來自胃腸道刺激信號并通過腦-腸軸投射到中樞神經系統產生反應；中樞也可激動或者抑制各種來自胃腸道的傳入信號，對內臟的活動功能進行調節[20]。近年來,腦腸肽在PSD發病過程中所起的作用引起廣泛關注，有研究顯示包括胃動素(MTL)、胃泌素(GAS)、P物質(SP)、膽囊收縮素(CCK)、神經肽Y(NPY)、降鈣素基因相關肽(CGRP)等十幾種腦腸肽是引起焦慮癥、抑郁癥或精神分裂癥等精神障礙疾患的關鍵介質[21-23]。有研究顯示，血清GAS含量的提升可顯著改善大鼠的抑郁狀態及胃腸功能失調，通過腦腸軸途徑調整腦腸肽的異常水平[24]，并且腦組織NPY的釋放可增加興奮性神經遞質含量，改善大鼠抑郁樣行為[25]，調節“延髓-脊髓-胃”腦腸軸通路中關鍵因子CGRP的含量，可能是其改善抑郁狀態與胃腸功能的作用機制之一。

本實驗中，曠場實驗、糖水消耗實驗均用來反映大鼠在造模以及應用各種干預手段前后行為學發生的相應改變。曠野實驗的原理是依據實驗動物在陌生環境中某些行為的發生頻率及持續時間，來反映其自主行為與探究行為，多用于抑郁或焦慮情緒的評價。糖水消耗實驗是通過大鼠對糖水的偏嗜，以此效仿人類的興趣感。模型組大鼠血清中的GAS、NPY含量均明顯降低，CGRP含量明顯升高，與行為學結果表現一致，說明本實驗造模成功并且腦腸肽的水平與PSD發展趨勢一致。經過滌痰湯治療后，中藥治療組大鼠狀態明顯好轉，與模型組比較其自主活動與興趣偏嗜明顯恢復，腦組織病理顯示腦組織炎癥減輕并且神經元損傷減少，血清GAS、NPY含量明顯升高同時CGRP含量明顯降低，說明滌痰湯有明顯的治療作用，其機制可能與腦腸肽家族關鍵響應子有關。

滌痰湯在臨床中用于治療PSD已經取得了明顯療效，本研究基于腦-腸軸學說觀察滌痰湯對PSD大鼠的治療作用，發現滌痰湯可通過調節GAS、NPY、CGRP的表達，發揮神經保護作用，緩解炎癥反應，改善精神萎靡、食欲下降、慢性腹瀉等相關癥狀，為臨床治療PSD提供了實驗依據。