銀翹散對流感病毒感染性重癥肺炎小鼠肺組織的修復機制研究*

王 佳，馮星火，國麗娜，王 妍

1.遼寧省人民醫院重癥醫學科(沈陽 110000)；2.沈陽市第六人民醫院(沈陽 110006)

流感是臨床最常見和多發的急性呼吸系統傳染病，若不給予有效的治療干預，極易引起重癥肺炎[1]。流感病毒感染所致重癥肺炎主要表現為患者的肺部發生彌漫性損傷，且病情進展迅猛，治療難度較大，死亡率高[2]。目前西醫對流感病毒感染所致重癥肺炎的治療方式主要為擴張支氣管、抗炎、抗感染、祛痰及機械通氣等綜合治療，但療效并不理想[3]。近年來中醫在治療重癥肺炎中越來越多被應用，并具有較佳的療效[4]。重癥肺炎患者會存在肺泡細胞及肺血管內皮等損傷，極易發展為急性呼吸窘迫綜合征，急性免疫損傷是流感病毒所致重癥肺炎患者死亡的主要原因，因此有必要針對肺損傷加強肺保護。本文通過對流感病毒感染重癥肺炎小鼠給予銀翹散治療，為中醫治療的作用機制提供有益的方法和探索思路。

資料與方法

1 材 料 選用BALB/cAnN 小白鼠60 只，(動物批準號：SCXK(京)2018-0021)60只，體重16～22 g，由中國醫學科學院動物研究所提供，飼養于清潔級實驗室中(室溫20°C～24°C，濕度40%～60%)觀察3 d后，用于實驗。

2 主要儀器與試劑 離心機(型號：5424r、美國Eppendorf 公司)、電子天平(型號：YP3001、常州市宏衡電子儀器制造)、切片機(型號：HM340E、德國LEICA公司)、全自動酶標儀(型號：Read Max 1900Plus，廠家：上海閃譜生物科技有限公司)、紫外分析儀(型號：UV-2000、上海科學儀器廠生產)、顯微鏡(型號：Olympus IX71，廠家：日本OLYMPUS)、電泳槽(型號：Bio-RaD，廠家：美國Bio-Rad公司)。

兔抗人NF-κB多克隆抗體(西安海寧生物工程有限公司)、Western blot及凝膠電泳試劑均購于南京凱基生物有限公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(上海碧云天生物技術有限公司)、IL-6、IL-1、TNF-α試劑盒均由北京美迪科生物技術有限公司提供， H1N1流感病毒(軍事醫學科學院微生物與流行病研究所免疫室提供)。銀翹散液制作：連翹、金銀花各30 g，薄荷、桔梗、牛蒡子各18 g，淡豆豉15 g，桑白皮、荊芥穗、大黃、甘草各 12 g，膽南星、地骨皮、苦杏仁、瓜蔞子各 10 g。蒸餾水煎煮3次，過濾、濃縮至含生藥2.5 g/ml，高壓滅菌后-4℃保存待用。

3 分組、模型制備及干預 將60只健康小鼠隨機分模型組(對照組)及治療組(觀察組)，各30只，兩組小鼠給予乙醚輕度麻醉，給予25 μl H1N1流感病毒滴鼻感染，感染量為1LD50。感染30 min后，對照組每日給予6 ml生理鹽水灌胃，觀察組給予銀翹散液灌胃，劑量為20 g/kg，每日2次灌胃(每次蒸餾水稀釋至3 ml)，連續7 d。

4 觀察指標

4.1 肺組織形態學觀察：兩組小鼠感染7 d后，分別取10只，處死取其肺組織，其中一部分切成1 mm3大小，0.3 %戊二醛和1 %的四氧化鋨進行固定，梯度丙酮脫水進行樹脂包埋，切片(厚度4 μm)經HE染色后，光鏡觀察并進行肺組織病理半定量評分，按照0～3分法對應病理改變程度(0分為正常，1分為輕度、2分為中度、3分為重度)分別從氣道粘膜上皮細胞脫落程度、毛細血管淤血程度、肺泡腔纖維蛋白滲出程度、中性粒細胞滲出程度、肺泡間隔增寬程度5個方面進行評分，最低分為 0分，最高分為 15分。

4.2 Western-blot法檢測肺組織NF-κB表達：兩組小鼠感染3、5、7 d后，取10只，處死，取其肺組織標本，采用改良異硫氰酸胍法提取肺組織總蛋白，取40 μg總蛋白，溶入等體積的緩沖液中煮沸10 min，經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離蛋白；將蛋白質轉印到硝酸纖維素膜(NC膜)上；20℃下，NC膜置入封閉液中振蕩封閉30 min，漂洗3次，加入NF-κB抗體(1∶1000稀釋)，脫脂奶粉封閉孵育過夜。加入二抗(1∶500)，孵育1 h，使用TBS洗膜3次，采用免疫熒光增強法檢測NF-κB蛋白的表達。

4.3 炎癥因子檢測：兩組小鼠感染3、5、7 d后，取10只處死，將肺組織標本制作成組織勻漿，冰氯化鈉溶液(2℃左右)漂洗后，離心機(3000 r/min)離心10 min，取上清，采用ELISA法檢測IL-6、IL-1、TNF-α水平，按照相關試劑盒說明書進行操作，酶標儀(波長450 nm)讀取OD值，并計算出IL-6、IL-1、TNF-α濃度。

4.4 肺W/D、TLW檢測：兩組小鼠感染7 d后，處死取右肺上葉組織，生理鹽水漂洗表面殘留血液，濾紙吸干后，進行稱重，記為濕重(W)，烤箱烘烤24 h(80 ℃)后，再次稱重，記為干重(D)，計算肺組織濕干比(W/D)=濕重/干重×100%；肺總肺水含量(TLW)的計算標準：TLW=(W-D)/D。

結 果

1 兩組小鼠肺組織形態情況 病理結果顯示，對照組小鼠的肺泡結構破壞嚴重，肺泡間隔明顯增寬，氣管上皮脫落，大量炎性細胞滲出，肺組織毛細血管淤血(圖1)。觀察組肺組織病理變化明顯改善，炎細胞浸潤減少， 肺泡間隔基本恢復正常，呈現出損傷及損傷后修復的形態學變化(圖2)。

2 兩組小鼠NF-κB及炎癥因子表達情況 干預治療3、5、7 d后，觀察組NF-κB表達水平明顯低于對照組，IL-6、IL-1、TNF-α的濃度明顯低于對照組(P<0.05)，見表1～4。

3 兩組小鼠肺組織W/D、TLW情況及病理評分情況 觀察組W/D、TLW及病理評分明顯低于對照組(P<0.05)，見表5。

表1 兩組小鼠不同時間NF-κB蛋白相對表達量

注：與對照組比較，*P<0.05

表2 兩組小鼠不同時間IL-6水平情況(pg/ml)

注：與對照組比較，*P<0.05

表3 兩組小鼠不同時間IL-1水平情況(μg/ml)

注：與對照組比較，*P<0.05

表4 兩組小鼠不同時間TNF-α水平情況(ng/L)

注：與對照組比較，*P<0.05

表5 兩組大鼠的W/D、TLW及病理評分比較

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

流感病毒不僅是導致流行性感冒的主要病原體之一，也是導致呼吸道感染性疾病的主要病原體，也是重癥肺炎的重要感染病原體[5]。重癥肺炎以肺部損害為主，并伴發多種器官功能衰竭，患者死亡率較高[6]。西醫主要通過擴張支氣管、抗感染、祛痰及營養支持等綜合治療，其療效存在一定局限性。我國傳統中醫認為，流感屬于“外感熱病”范疇，重癥肺炎屬于“肺閉”、“喘咳”等范疇[7-10]，其發病機制為疫毒蘊結，耗氣傷津，熱邪外侵，先侵犯肺臟，肺氣郁閉，形成血瘀，肺失宣肅，治療原則以活血化瘀，宣肺止咳為主[11]。

銀翹散藥方最早出現在清代，其主要由金銀花、連翹、桔梗、甘草、薄荷、牛蒡子等多味中藥組成，具有清熱解毒，宣肺止咳的功效[12-15]。其中連翹和金銀花具有疏散風熱，清熱解毒的功效；薄荷和牛蒡子具有疏散風熱，辛涼宣散的功效；桔梗具有止咳利咽，開宣肺氣的功效，甘草可調和藥性，并可利咽止咳[16-19]。流感病毒感染所致重癥肺炎的發病機制十分的復雜，其中持續的炎癥反應是導致患者重癥的主要原因，患者預后與炎癥反應密切相關，控制病毒感染引起的持續不可控的炎癥反應是降低患者死亡率的關鍵[20]。TNF-α是機體最早產生的炎癥介質，可誘發和放大炎癥反應[21]。IL-6會誘導炎癥細胞黏附、聚集，導致肺血管的通透性増加，引起肺間質水腫[22]。IL-1是一種促炎性細胞因子，在局部起免疫調節作用，可參與損傷的肺泡上皮的修復[23]。NF-κB是一種重要炎癥介質，炎癥反應的起始階段起促進作用[24]。本研究結果顯示，干預治療3、5、7 d后，觀察組NF-κB表達水平明顯低于對照組， IL-6、IL-1、TNF-α的濃度明顯低于對照組，這是可能是因為銀翹散中的金銀花具有廣譜的抗菌作用，對各種病菌有較強的抑制作用，對流感病毒等病源微生物也具有較強的抑制作用，可有效抑制流感病毒對肺部的損傷[25-28]。現代藥理論學認為，連翹具有抗微生物的作用，具有顯著抗炎作用，并可抗肝損傷。甘草中甘草甜素可對流感病毒進行直接的清除，并增加機體免疫能力，參與機體免疫應答，減輕機體的免疫病理損傷[29-30]。肺泡上皮損傷會激活炎性反應網絡，引起肺的炎癥反應。通過對小鼠給予銀翹散干預治療，可有效解除流感病所致重癥肺炎的氣滯血瘀狀態，通過抑制相關炎癥因子，降低肺泡毛細血管的通透性，對肺部炎性滲出、出血及水腫等產生緩解作用，減輕肺泡-毛細血管屏障的損傷，促進肺損傷的修復，因此W/D和TLW及半定量病理評分也隨之降低。

綜上所述，銀翹散可對流感病毒感染所致重癥肺炎具有良好的干預效果，可通過調節各種炎癥因子水平，達到修復免疫病理損傷的目的，對流感病毒感染所致重癥肺炎的中醫治療具有重要的指導意義。