超高效合相色譜技術在國內的應用

廖 蕓，鐘雪蓮，莫月香，胡劍燦，羅 峻*

(1.廣州纖維產品檢測研究院，廣東 廣州 511447；2.廣州檢驗檢測認證集團有限公司，廣東 廣州 511447)

Waters公司基于超臨界流體色譜技術，于2012年推出一款新型分析儀器-超高效合相色譜(Ultra Peroformance Convergence Chromatography,UPC2)。該技術以超臨界CO2為主要流動相，具有傳質性好、分離效果佳、綠色環保等特點。與液相色譜(LC)技術相比，使用無毒的CO2作為流動相，流體黏度低、擴散率高，綠色環保，可減少對環境和實驗人員的健康危害；與氣相色譜(GC)技術相比，具有更廣的適用范圍和更加快速、高效的分離能力。

1 簡介

Waters ACQUITY UPC2儀器由合相色譜管理器、二元溶劑管理器、樣品管理器、柱溫箱管理器和檢測器五個部分構成[1]。合相色譜管理器是儀器核心部件，主要起到控制CO2流體的作用，提供穩定的壓力環境。系統可根據分析需求，連接PDA、MS和ELSD等檢測器。目前國內的報告所使用的檢測器以PDA和MS為主。

在超高效合相色譜系統中，色譜柱、助溶劑、系統背壓、色譜柱溫度等參數的選擇會影響目標物的分離效果。色譜柱的選擇在參數優化中起著關鍵作用，Waters公司提供了固定相不同的四種色譜柱，ACQUITY UPC2BEH色譜柱、ACQUITY UPC2BEH 2-EP色譜柱、ACQUITY UPC2CSH Fluoro-Phenyl色譜柱和ACQUITY UPC2HSS C18 SB色譜柱。在此基礎上，Waters公司還開發了ACQUITY UPC2Trefoil系列手性柱和ACQUITY UPC2Torus系列非手性柱，為化合物的有效分離提供了更多選擇。助溶劑的加入能夠改變超臨界流體的溶劑化能力，進而改變目標物的分離效果，常用的助溶劑有甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈。系統背壓和色譜柱溫度的改變影響流體密度，從而改變溶劑化能力，導致目標物出峰時間改變。值得注意的是，在傳統液相中，隨著溫度的升高，目標物出峰時間往往縮短，而在超高效合相色譜中，溫度的升高會導致超臨界流體黏度的降低，溶劑化能力變小，目標物出峰時間延長。

2 應用

近幾年，超高效合相色譜技術得到了快速的發展，在食品、紡織品、藥品、化工產品等領域均得到了應用，表1 是近幾年國內發表的采用UPC2技術進行研究分析的文獻資料匯總。

2.1 食品方面

食品安全直接關系著人體健康安全問題，受到國人的高度重視。食品品質與安全的測定分析一直是研究的重點。

近期，章璐幸等[2]建立了免疫親和固相萃取( IAC-SPE) -超高效合相色譜-串聯質譜( UPC2- MS /MS) 同時測定牛奶中6種玉米赤霉醇類化合物殘留的方法。該方法基體效應小，專屬性好，操作簡便快速。牛奶樣品經去離子水稀釋后，IAC-SPE富集凈化，采用具有較強選擇性的ACQUITY UPC2Torus 2-PIC色譜柱分離，ESI-模式下進行檢測。6種目標物在1～200 ng/mL的范圍內線性良好，平均回收率在75.9%～106.5%之間，日內和日間精密度都≤11.4%。周圍團隊[3-5]使用超高效合相色譜分析食品中的維生素C、抗氧化劑，所建立的方法均具有良好線性、準確度和精密度。在建立的油脂及其制品中5種抗氧化劑的超高效合相色譜法時，與超高效液相色譜法(UPLC)進行了比較，UPC2與UPLC相比具有更短的分析時間，更好的分離效果和更準確的定量結果，適用于高通量檢測。UPC2還被用于檢測食用植物油中的常見脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸)[6]和丁基羥基茴香醚(BHA)和二丁基羥基甲苯(BHT)[7]。前者樣品經皂化反應處理，UPC2-MS分析，在0.5～100 mg/L的范圍內，相關系數為0.9985～0.9998，回收率為89.61%～108.50%，方法重復性標準偏差為0.69%～3.01%；后者使用正庚烷-異丙醇溶劑溶解稀后，渦旋振蕩后，經UPC2-PDA測定，在50～200 mg/kg的范圍內，相關系數>0.99，BHA和BHT的平均回收率在93.8%～99.4%的范圍內，相對標準偏差在0.5%～4.0%之間。此外，UPC2還成功的應用在蜂蜜[8]、茶葉[9-11]、酒[12-14]等食品中分析化合物的快速檢測，為食品質量的監管提供新的技術支持。

2.2 紡織方面

隨著人們物質生活水平的提高，對紡織服裝的安全性問題的關注也越來越高。對紡織品中的有毒有害物質的分析，通常使用氣質聯用法、高效液相色譜法、氣相色譜法、分光光度法等進行，而超高效合相色譜法目前在紡織行業也得到了應用。

丁友超等[15]采用超高效合相色譜技術測定紡織品中11種致敏分散染料，對色譜柱、助溶劑、系統背壓等參數進行了優化，11種目標物在2.0～50 mg/kg的范圍內，線性相關系數均大于0.999，定量限、平均回收率和相對標準偏差分別在1.44～1.98 mg/kg、90.3%～97.9%和2.9%～5.3%之間，8 min內就能將11種目標物分離，方法快速準確，綠色環保。經熒光增白劑處理過的紡織品，品質得到提高，但熒光增白劑對皮膚有刺激作用，使免疫系統受損，湯娟等[16]建立了紡織品中8種熒光增白劑的超高效合相色譜法。該方法8種目標物在1.0～20.0 mg/L的范圍內線性良好，回收率在90.9%～96.5%之間，相對標準偏差在2.8%～4.2%之間，操作簡便，分析快速，結果可靠。錢凱[17]等將加速溶劑萃取技術與超高效合相色譜技術相結合，建立了滌綸樣品中禁用偶氮染料的分析方法，避免了傳統方法中二甲苯、氯苯的使用，污染小，分析快速。

2.3 藥品方面

醫藥行業是我國國民經濟的重要組成部分，對保障和增進人體健康起著至關重要的作用。藥品以及保健品含量測定是分析研究的重點，特別是中藥有效成分的測試、指紋圖譜的建立，對中藥現代化，走向國際化提供了幫助。

脂溶性維生素結構極不穩定，同時測定多種脂溶性維生素是檢驗技術的難點，少有這方面的研究報道。周圍等[18]采用超高效合相色譜技術測定復合維生素片中11 種脂溶性維生素及其衍生物，方法前處理操作簡便，采用渦旋振蕩，避免了維生素在前處理過程的損失，分析時間短，在12 min內就能實現11中脂溶性維生素及其衍生物的有效分離，結果準確可靠，回收率在97.31%～98.76%之間，相對標準偏差為0.41%～0.96%。王波等[19]建立了超高效合相色譜法快遞分離和測定黃芪中5種黃酮類化合物的方法，分析速度達到傳統液相色譜的3倍以上。朱瑞娟等[20]采用超高效合相色譜法建立了補腎健腦顆粒及各藥材提取物的指紋圖譜，明確了補腎健腦顆粒中15個主峰的來源，并且能夠將UPLC 法無法分離的β-蛻皮甾酮和松果菊苷進行有效的分離，同時獲得更短的分析時間。超高效合相色譜法可應用在中成藥及原料藥中的香豆素的測定[21]，結合溶劑誘導相變萃取前處理技術，回收率能達到89.8%～102.3%，分析時間僅為UPLC的1/4。在螺旋藻保健食品中類胡蘿卜素[22]、藥品中鹽酸蘭地洛爾立體異構體[23]的測定也采用了超高效合相色譜法。

2.4 化工產品方面

劉靜等[24]建立了聚烯烴材料中15種抗氧劑的超高效合相色譜法，對色譜柱、助溶劑、柱溫及系統背壓等條件進行優化得到最佳分離條件，15種目標物4.5 min內就可實現基線分離，方法分析時間短，成本低，綠色環保。在分析塑料制品中的18種多環芳烴的超高效合相色譜法中[25]，Daicel IB-3(纖維素3-(3，5-二甲基苯甲酰胺)手性色譜柱比BEH-EP、CSH Fluoro-phenyl、HSS C18 SB色譜柱具有更佳的分離效果，建立的方法分離時間僅需8.5 min，而常規方法需要30～40 min。李武林等[26]建立了采用超高效合相色譜檢測塑料中15種鄰苯二甲酸酯的方法，在0.5～10 mg/L的線性范圍內，相關系數均大于0.996，檢出限為1.0～2.2 mg/kg，回收率在78.1%～122.3%之間，相對標準偏差在2.95%～8.26%之間，8min內即可實現15種鄰苯二甲酸酯的分離檢測。李中皓等[27]采用超高效合相色譜技術分析紙質印刷包裝材料中10 種光引發劑，樣品經乙腈超聲萃取過濾后上機測試，利用ACQUITY UPC2CSH Fluoro- Phenyl 色譜柱分離，4 min內實現10中光引發劑的分離，方法快速簡便，結果準確。馬明等[28]建立了超高效合相色譜法測定尼龍6食品接觸材料中己內酰胺遷移量的方法，方法簡便環保。

2.5 其他方面

除了食品、紡織品、藥品、化工產品等領域的應用，超高效合相色譜技術在代謝組學研究、化妝品等領域也發揮著重要作用。

張淑麗等[29]采用超高效合相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用(UPC2-Q/TOF-MS) 技術對果糖誘導高尿酸血癥大鼠血清進行了脂質代謝組學研究，采用多元統計分析方法比較高尿酸血癥大鼠(模型組) 和正常大鼠(對照組) 血清代謝差異，確定了8種潛在生物標記物，此間使用的UPC2-Q/TOF-MS技術，無需對脂質樣品衍生化，簡化流程，分析快速，獲得包含更多數目的代謝譜圖。張元等[30]建立了采用高效合相色譜技術同時分離測定血漿中12種磺胺類藥物的方法，在一定范圍內線性良好，相關系數均大于0.999，檢出限為0.15～0.35 μg/mL，回收率在86.2%～99.5%之間，方法分析時間短，分離效率高，環保。隨著化妝品使用率的提高，其安全性也越來越受到消費者的關注。徐莉團隊[31-32]采用超高效合相色譜技術測定化妝品中的性激素、防曬劑，方法前處理過程簡單，并且具有良好的準確度和精密度，為化妝品的質量監管提供新技術。劉靜等[33]采用超高效合相色譜和超高效液相色譜測定飼料中的5種非法添加染料，兩者比較，UPLC比UPC2具有更高的靈敏度，更好的線性，而UPC2比UPLC具有更高效快速的分析能力。張洪非等[34]建立了超高效合相色譜分析卷煙煙氣中8種重要羰基化合物的方法，該方法測試結果與標準方法YC/T 254-2008無顯著性差異，化合物的分析時間可縮短至標準方法的1/4，更高效。郭衛蕓等[35]建立了煙草中四溴菊酯和溴氰菊酯殘留的超高效合相色譜法，該方法彌補了氣相色譜法無法檢測四溴菊酯的不足(四溴菊酯在氣相色譜儀進樣口極易發生分解)，也避免了液相色譜串聯質譜法使用大量有機試劑的缺陷(流動相甲醇占比高)。

表1 UPC2在國內的應用

表1(續)

表1(續)

3 結論

超高效合相色譜技術推出至今，在食品、紡織品、藥品、化工產品、化妝品等領域得到廣泛的應用。超高效合相色譜以超臨界CO2為流動相，結合了氣相色譜和液相色譜的優點，彌補了氣相色譜和液相色譜的不足，既能應用于難以氣化、高溫下易分解的物質，又大大縮短了分析時間，提高了分離效率，綠色環保。超高效合相色譜技術的發展，為分析領域注入了新的力量。