三氯卡班對蚯蚓的氧化脅迫及DNA損傷

李倩倩，李光德,*，閆曉彤，劉斌，李紫薇

1. 山東農業大學資源與環境學院，泰安 271018 2. 山東省高校農業環境重點實驗室，泰安 271018

三氯卡班(triclocarban, TCC)是個人護理產品中主要有機成分之一[1]，由于其殺菌(細菌和真菌)、無毒、無刺激性、皮膚接觸無過敏反應，且與皮膚有良好的相容性等特性被廣泛用于廚房洗滌劑、化妝品和兒童玩具等消費產品中[2-3]，且經常在自然環境、野生生物和人體組織中被檢出[4]。在中國遼河、海河、黃河、長江和珠江等的表層水和沉積物中，TCC的檢出率為100%，最高濃度達2 723 ng·L-1[5]。在污水處理廠產生的污泥中，TCC含量高達10.0～70.0 mg·kg-1，有95%的污泥被用作耕地的土壤有機質補給，污泥農用將導致TCC進一步進入土壤中，加劇土壤環境污染[6]。陳鳳[7]在廣州省、河北省污泥農用土壤中均檢測到TCC的存在，并根據生態風險評價得出TCC對陸生生物具有高風險。Yin等[8]已在人類尿液和指甲中檢測到TCC的存在，且濃度高達84.66 μg·kg-1和41.05 μg·kg-1，這表明中國人群身體組織中已有TCC的積累。

TCC的物化性質穩定，在環境中較難降解，很容易在土壤、污水處理廠污泥和沉積物等環境介質中富集，是一種潛在的持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)。Halden和Paull等[9]發現TCC在沉積物、土壤、水和大氣中的半衰期分別為540、120、60和0.75 d。汪貞等[10]通過應用物種敏感性分布方法對我國地表水中TCC進行生態風險評估，得出TCC高風險比例為28.6%，中風險比例高達47.6%，TCC對我國淡水環境的影響應當引起環境管理部門的重視。隨著TCC使用量的急劇增加，其對自然環境的污染水平、對生物體的毒性效應和對生態系統造成的潛在影響不容忽視。

多項研究表明，TCC能對人和動植物引起各種不良反應，可通過抗氧化劑生物標志物包括過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)和過氧化脂質(LPO)進行監測。由于接觸含TCC成分的消費產品的時間更長，女性會更易受TCC的影響[11]。大量研究證明，TCC對動植物和人體的生長發育存在抑制效應，干擾其內分泌以及遺傳等。Kajta等[12]將神經元細胞暴露于TCC中24 h后發現，TCC會抑制ESR1和GPER1的mRNA和蛋白質表達，通過基因的甲基化破壞雌激素受體的信號傳導。Dong等[13]研究發現，133.3 mg·L-1水平的TCC可使斑馬魚心率降低，抑制膀胱發育，還會抑制其甲狀腺激素，并改變甲狀腺激素反應基因的表達。楊峰等[14]發現3.57 μmoL·L-1的TCC可抑制腎小管上皮細胞間緊密連接蛋白JAM-1的表達，從而影響腎臟的屏障功能。施金彤等[15]的研究證明，TCC能誘導正常的小鼠乳腺上皮細胞發生癌變；李林朋等[16]通過彗星實驗發現，TCC能引起人體肝臟細胞的DNA損傷，且呈現出明顯的“劑量-效應”關系。

目前，國際上對TCC的研究主要集中于TCC對水生生物、土壤微生物以及哺乳動物的生態毒性效應及其在環境中的降解、轉移等，而TCC對土壤動物蚯蚓的毒性效應研究報道甚少。蚯蚓對土壤污染物質的反應可作為評價土壤污染和土壤質量的指標[17]，是土壤污染預警和診斷的一種工具[18-19]。赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)是國際上常用于蚯蚓毒性試驗的品種，因此，本文以赤子愛勝蚓為研究對象，使其暴露于不同TCC含量染毒的人工土壤中[20]，從細胞水平上研究TCC對蚯蚓抗氧化酶系包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、CAT和GST活性，活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量的影響，以及對細胞DNA的損傷程度，用以探究TCC的生態毒理學性質，這對評估TCC對環境的影響尤為重要。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

藥品試劑：三氯卡班標準品(純度>99.5%)、L-甲硫氨酸、愈創木酚和瓊脂糖購自美國Sigma-Aldrich公司；考馬斯亮藍購自北京瑞泰科技有限公司；核黃素和丙三醇(分析純)購自天津市凱通化學試劑有限公司；牛血清白蛋白和十二烷基氨酸鈉(分析純)購自上海伯奧生物技術有限公司。

供試生物：赤子愛勝蚓購于日照老兵蚯蚓養殖場，挑選環帶明顯、大小(體質量300～600 mg)一致的健康成蚓，試驗前在配制的人工土壤中馴化一周。

供試土壤：按照經濟合作與發展組織(OECD)推薦的標準配制人工土：10%的干燥泥炭蘚(pH值5.5～6.0)；20%的高嶺粘土(約含高嶺石成分50%)；69%的工業石英砂(約含50%的50～200目細顆粒)；1%碳酸鈣(調節人工土pH值到6.0±0.5)。

1.2 試驗設計

試驗TCC染毒設定濃度為0(以丙酮作空白對照)、5、10、20和40 mg·kg-1。染毒試驗前，根據試驗染毒濃度設置，將TCC溶于丙酮后配制成相應系列濃度的標準工作溶液。按配比稱取500 g人工土后放置于l L干燥燒杯中，先取10 g土樣與一定量系列濃度標準工作溶液充分混勻，再與490 g土樣充分混勻，待丙酮溶劑揮發完全后加適量去離子水，調節水分至土壤干質量的35%左右，明暗時間比為12 h∶12 h。每個濃度處理設3個重復。選取15條符合要求的蚯蚓放入燒杯中，用預先扎孔的保鮮膜封口，將燒杯放置于(20±1) ℃培養箱中，調節光暗。在培養第7、14、21和28天，自燒杯中取出蚯蚓，用生理鹽水沖洗干凈后放置于放有濕潤濾紙的培養皿中，在(20±1) ℃的培養箱中過夜吐泥，取樣測定相關指標。

1.3 測試指標及方法

選擇SOD、CAT、POD、GST、MDA和ROS作為蚯蚓氧化損傷指標，其中，SOD活性檢測采用氮藍四唑(NBT)光還原法，CAT活性測定采用紫外分光光度計法，POD活性檢測采用愈創木酚比色法，MDA含量檢測采用硫代巴比妥酸法，GST活性檢測采用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)比色法[21-22]。ROS含量測定采用二氯熒光素(DCFH-DA)熒光法測定[23]。

TCC對蚯蚓體腔細胞DNA損傷的測定采用彗星實驗(Comet Assay)，又稱單細胞凝膠電泳實驗(SCGE)。根據Singh等[24]和Song等[25]的研究方法，結合實驗情況做適當的調整。溴化乙錠染色后，采用熒光倒置顯微鏡觀察玻片、拍照、存取結果，用CASP軟件分析蚯蚓體腔細胞DNA的彗星圖片，測定Olive尾矩。

1.4 數據處理

使用Excel 2016對全部數據進行統計分析。通過SPSS 19.0進行單因素方差分析(ANOVA)，檢測分析不同處理組與空白組之間的差異顯著性。顯著性差異水平設定為P<0.05。結果以平均值±標準差(mean±SD，n=3)的形式表示。

2 結果(Results)

2.1 TCC對蚯蚓的氧化脅迫效應

2.1.1 TCC對SOD活性的影響

由圖1可知，在整個實驗周期內，在TCC脅迫作用下，蚯蚓體內的SOD活性大致呈現先激活后被抑制的情況。染毒處理7 d時，SOD活性較空白組變化不大；14 d后，濃度低于20 mg·kg-1的處理組SOD活性均高于空白組，且存在顯著性差異(P<0.05)，高濃度處理組活性雖高于空白組，但與空白組差異性不顯著；處理21 d時，除40 mg·kg-1處理組的SOD活性小于空白組的，其余濃度處理組SOD活性均高于空白組，且與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，但各處理組之間差異性不大；染毒處理28 d時，相比于空白組，各濃度處理組的SOD活性明顯受到抑制，且隨TCC濃度的升高呈下降趨勢。

圖1 三氯卡班(TCC)對蚯蚓體內超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響注：每組中不同的小寫字母表示處理間差異達到顯著水平(P<0.05)；下同。Fig. 1 Effects of triclocarban (TCC) on activities of superoxide dismutase (SOD) in earthwormsNote: Different small letters meant significant difference among treatments at P<0.05; the same as below.

2.1.2 TCC對CAT活性的影響

由圖2可知，在整個實驗周期內，高濃度處理組(40 mg·kg-1)CAT活性始終被抑制，其余處理組活性則被激發。在TCC染毒處理7 d時，CAT活性(除40 mg·kg-1處理組)較空白組略有增長，但激活程度不顯著；染毒14 d后，各處理組CAT活性被激發；21 d時，各處理組的CAT活性均激活到最高程度，并在10 mg·kg-1處理組活性值達到最大，與空白組相比增加了31.17%，激發效果顯著(P<0.05)。第28天時，20 mg·kg-1處理組CAT活性仍高于空白組，但激活程度明顯低于5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理組。

圖2 TCC對蚯蚓體內過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig. 2 Effects of TCC on activities of catalase (CAT) in earthworms

2.1.3 TCC對POD活性的影響

由圖3可知，隨著TCC染毒濃度的增加和染毒時間的延長，蚯蚓POD活性也呈現先增加后降低的趨勢。在染毒第7～14天，各處理的POD活性均被不同程度地激發，且與空白組相比，差異性顯著(P<0.05)。染毒21 d后，5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理組的POD活性被顯著激活，但2個不同濃度處理組之間差異性不明顯，高濃度處理組(40 mg·kg-1)的POD活性則被抑制。染毒至28 d時，各濃度處理組的POD活性隨暴露濃度的增加，抑制作用明顯增強。

圖3 TCC對蚯蚓體內過氧化物酶(POD)活性的影響Fig. 3 Effects of TCC on activities of peroxidase (POD) in earthworms

2.1.4 TCC對蚯蚓GST活性的影響

由圖4可知，GST的活性在染毒初期受到輕微抑制，后逐漸被激活升高，在染毒第14天時達到最高值，最終在染毒28 d時被抑制。在染毒7 d后，各濃度處理組GST活性受到抑制，40 mg·kg-1處理組活性較空白組降低20.1%。染毒14 d時，蚯蚓受TCC刺激變明顯，使各處理組的GST活性迅速增加，且在40 mg·kg-1組GST活性達到最高。21 d時，染毒組GST活性雖高于空白組，但較染毒14 d時的GST活性降低。在染毒28 d后，GST活性受抑制，但各濃度處理組間無顯著性差異。

圖4 TCC對蚯蚓體內谷胱甘肽S-轉移酶(GST)活性的影響Fig. 4 Effects of TCC on activities of glutathione transferase (GST) in earthworms

2.1.5 TCC對蚯蚓體內MDA含量的影響

由圖5可知，在整個染毒周期內，除個別處理組外，經TCC處理的樣品中MDA含量始終高于空白組，且與空白組之間存在顯著性差異(P<0.05)。染毒第7天時，各處理組MDA含量開始增加，且在20 mg·kg-1時達到最大值。染毒第14～21天時，除14 d的40 mg·kg-1處理組外，隨著暴露濃度的升高，各處理組的MDA含量也隨之升高。第28天時，蚯蚓體內MDA含量的增長趨勢有所減緩。

圖5 TCC對蚯蚓體內丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 5 Effects of TCC on contents of malondialdehyde (MDA) in earthworms

2.1.6 TCC對蚯蚓體內ROS含量的影響

由圖6可知，不同濃度的TCC均可誘導蚯蚓體內ROS的含量上升，且隨著染毒時間的增加，蚯蚓體內ROS含量呈先升高后緩慢降低至空白的趨勢。染毒第7天時，5 mg·kg-1處理組ROS含量低于空白組，其余處理組ROS含量則隨染毒濃度的增加而增加。第14天時，各處理組ROS含量均顯著高于空白組，并在20 mg·kg-1處理組達到最大值，比空白組增加了80.43%；21 d時，各處理組蚯蚓體內ROS依舊呈現高于空白組的狀態，但與空白組的差距逐漸變小，且低于14 d時蚯體內ROS的含量；第28天時，各處理組ROS含量略有降低，并接近于空白組。

圖6 TCC對蚯蚓活性氧(ROS)含量的影響Fig. 6 Effect of TCC on content of reactive oxygen species (ROS) in earthworms

2.2 TCC對蚯蚓體腔細胞DNA的損傷

不同濃度TCC脅迫對蚯蚓體腔細胞造成的損傷如圖2～圖7所示。由圖7可知，空白組的蚯蚓體腔細胞細胞核頭部呈致密的圓形，邊緣清晰，無拖尾或尾部極短。經TCC染毒后，染毒組的細胞核結構受到損傷，DNA頭部逐漸變小、變松散，在外加電場下，斷裂的DNA漸漸地離開細胞核向陽極遷移，呈掃帚狀，形成類似彗星拖尾的圖案，核DNA的斷裂程度和彗星拖尾的長度隨染毒濃度的增大而加長。

圖7 暴露于TCC的蚯蚓體腔細胞彗星實驗圖像Fig. 7 Typical comet image of earthworms coelomocyte exposed to TCC

用CASP軟件分析彗星圖像，得到TCC對蚯蚓體腔細胞的Olive尾矩的影響，如圖8所示，Olive尾矩反映蚯蚓體腔細胞DNA的遷移。5～40 mg·kg-1的TCC均可對蚯蚓體腔細胞DNA造成損傷，且Olive尾矩隨染毒濃度和時間的增加而增加，與空白組相比差異性顯著。第28天時，20 mg·kg-1和40 mg·kg-1處理組的彗星Olive尾矩較21 d時增長幅度減緩，可能是因為蚯蚓在應對外界TCC毒性時，經過一段時間的應激反應后慢慢進行自我修復。

圖8 TCC對蚯蚓體腔細胞DNA損傷Olive尾距(OTM)的影響Fig. 8 Effect of TCC on DNA damage Olive tail moment (OTM) in earthworm coelomocyte cells

3 討論(Discussion)

3.1 TCC對蚯蚓抗氧化酶系和GST活性的影響

CAT是生物防御體系的關鍵抗氧化酶之一，廣泛存在于細胞的過氧化物內。它可清除體內的H2O2，促使其分解為分子氧和水，使機體免受來自H2O2的損害。40 mg·kg-1處理組CAT活性在整個實驗周期內始終被抑制，說明高濃度TCC對蚯蚓造成的氧化脅迫程度過大，機體細胞膜受到氧化損傷，導致機體中毒，CAT產生機制受損，并且機體持續累積H2O2的速度大于CAT的清除速度，導致H2O2在機體內累積，抑制了CAT的合成，使機體內的CAT含量降低。除個別濃度處理組外，各濃度處理組的CAT活性始終高于空白組，且隨著染毒時間的增加，CAT活性呈現先升高后降低的趨勢，染毒處理21 d時，20 mg·kg-1濃度組使CAT活性激發至最大。

GST是細胞的主要解毒酶，能夠催化機體內谷胱甘肽(GSH)與有毒物質結合，使其轉化為水溶性化合物隨尿液等排出體外，達到解毒目的。染毒7 d時，GST活性受到抑制，可能是由于抗氧化系統應激作用的延遲，TCC脅迫下蚯蚓體內的ROS和H2O2等含量上升，部分GST被消耗，活性降低。高濃度處理組GST活性顯著激活，可能是在高濃度作用下，機體中其他抗氧化酶系發揮的作用低于中低濃度組，需刺激GST活性來維持機體的平衡。染毒第28天，GST活性被抑制，濃度越高，受抑制程度越大，表明長時間及高濃度脅迫下，機體內活性氧等有毒物質的產生速率大于其清除速率，累積的有毒物質對蚯蚓產生影響，阻礙了GST酶蛋白的合成，降低了GSH與有毒物質的合成，導致GST的解毒能力下降。

3.2 TCC對蚯蚓MDA和ROS含量的影響

MDA是細胞膜中自由基與不飽和脂肪酸氧化反應的主要產物[32]，其含量的多少可直接反映機體脂質過氧化的程度，間接反映自由基對機體的損傷程度[21]。含量越高，表明機體受損傷程度越大[33]。染毒初期，受TCC刺激產生且未被抗氧化酶系及時清除的活性氧自由基與細胞膜發生過氧化反應，脂質過氧化作用增強，導致MDA含量升高。實驗后期，除個別濃度組外，蚯蚓體內MDA含量隨著時間和TCC濃度的增加而增加，說明在TCC脅迫下蚯蚓機體產生的ROS含量增加，過量的ROS反過來抑制抗氧化防御系統的活性，抗氧化酶系無力應對過量的自由基，從而引起細胞的脂質過氧化作用增強，使MDA的含量增加。

ROS是機體正常代謝的產物。環境中的多數外源污染物都能影響機體內氧化還原系統的平衡，促使機體產生大量的ROS，引起膜脂過氧化作用，導致一系列有害的生理生化變化[25]。ROS在調節細胞分化及死亡過程中起到至關重要的作用[34]。在本實驗整個染毒周期內，各處理組ROS含量始終高于空白組，且在14 d時差異性較為顯著，表明TCC對蚯蚓機體造成了明顯的損傷。Shao等[35]的實驗中同樣發現離子液體會導致蚯蚓體內ROS含量上升。說明TCC脅迫會導致蚯蚓體內ROS含量增加，打破機體ROS產生和消除的動態平衡，進而直接或間接破壞蚯蚓抗氧化防御系統。21 d后，各處理組ROS含量仍高于空白組，但各濃度處理組ROS相比14 d時呈現出下降的趨勢，說明蚯蚓機體具有一定自我修復的能力，且本試驗中染毒物質的濃度并未對蚯蚓機體造成不可逆的損害。但在整個實驗周期內，染毒濃度對蚯蚓體內ROS含量的影響并無明顯規律。

3.3 TCC對蚯蚓DNA損傷的影響

實驗設置濃度均可對蚯蚓體腔細胞DNA造成損傷，且低濃度時即可對體腔細胞產生基因毒性效應，說明蚯蚓對TCC有較高的敏感性。隨著染毒濃度、染毒時間的增加，損傷也隨之增加，這說明DNA損傷程度與TCC的劑量呈正相關。環境中TCC濃度的增加，破壞了細胞的膜結構，導致進入蚯蚓體內的TCC含量增加，大量的TCC對蚯蚓的氧化脅迫作用加強，抑制了蚯蚓機體的解毒能力及自我修復能力，加劇細胞DNA的損傷。染毒第28天，各處理組蚯蚓Olive尾距(OTM)值的增長幅度減緩，與21 d時差距不大，機體ROS含量回落接近于空白水平，表明蚯蚓機體開始自我修復，削弱了TCC對蚯蚓細胞的損傷程度。損傷較輕的細胞通過DNA自我修復機制將損傷逐漸降低，直至恢復至正常水平[36]。

綜上所述，TCC能對蚯蚓機體產生一定程度氧化脅迫，刺激蚯蚓機體產生大量的ROS，從而激活體內的抗氧化酶和解毒酶來消除過量的ROS，維持正常的氧化還原應激反應。過量的ROS還會造成細胞膜脂質過氧化，產生過氧化產物MDA，對細胞DNA造成損傷，導致細胞凋亡。本研究證實了TCC能夠對蚯蚓機體產生氧化脅迫及DNA損傷，但研究內容有限，還需更深入探究。