青蟹對As和Cd的生物富集動力學特性

喬藝飄，張龍飛，劉歡，婁曉祎，黃冬梅，黃宣運，韓峰，史永富,*

1. 中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部水產品質量監督檢驗測試中心(上海)，上海 200090 2. 上海海洋大學食品學院，上海 201306 3. 中國水產科學研究院，農業農村部水產品質量安全重點實驗室，北京 100141

擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)屬節肢動物門(Arthropoda)，甲殼綱(Crustacea)，十足目(Decapoda)，梭子蟹科(Portunidae)，青蟹屬(Scylla)，其環境適應性強，生長速度快。在印度洋地區以及日本、泰國和菲律賓等國家均有分布，在中國主要分布在浙江、廣東、廣西和福建等沿海地區[1]。青蟹已成為中國重要的海洋經濟動物，2018年，海水養殖青蟹面積23 129 hm2，養殖產量達15.77萬t[2]。但隨著近年來工農業的迅速發展，城市生活污水、工業廢水以及礦山開采和金屬冶煉等所產生的污染物通過不同方式排入水體中，使水體中的重金屬濃度急劇升高。養殖水體也受到較大影響，進而導致養殖水產品受到重金屬的污染[3]。

甲殼類生物比其他水產品具有更強的重金屬富集能力，這點已有諸多研究證實，如陳偉珍等[4]對湛江市售魚類與甲殼類海產品重金屬濃度研究發現，甲殼類受鎘(Cd)污染較嚴重；施沁璇[5]研究錢塘江流域杭州段水產動物中重金屬分布特征并進行了安全性評價，發現甲殼類中銅(Cu)和Cd的濃度顯著高于其他品種。此外，海洋生態系統被稱為全球砷(As)循環的“As庫”，海水中As的濃度最高可達24 μg·L-1[6]。As進入水生生物體內后不斷累積富集，導致許多魚類、甲殼類生物體As濃度高至10～100 mg·kg-1(濕重)[7]。As和Cd可與含有巰基(—SH)的大分子基團緊密結合成金屬螯合物，抑制酶活性，阻礙細胞的呼吸和氧化功能，干擾機體生理生化多方面的活動，具有致畸致癌性[8-9]。

因此，近年來對重金屬在海洋生物體內的富集動力學研究引起了國內外學者們的持續關注。雙箱動力學模型作為應用最廣泛的經典模型之一，可以較好地反映暴露條件下水生生物對重金屬的富集特征，在水生生物中已有較多的應用報道[10-11]，包括大型海藻如龍須菜(Gracilarialemaneiformis)[12]，貝類如斑馬貽貝(Dreissenapolymorpha)[13]、褶牡蠣(Alectryonellaplicatula)[14]等，魚類如黑鯛魚(Acanthopagrusschlegeli)[15]，蟹類如中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[16]以及其他淡水大型無脊椎動物和水生植物[17]對重金屬的富集動力學研究。青蟹作為重要的海洋經濟動物之一，目前尚未見到重金屬在其體內的富集與釋放特性的相關報道。該研究以擬穴青蟹為研究對象，使用雙箱動力學模型，對As和Cd的富集與釋放過程的雙曲線擬合，探討了As和Cd在青蟹體內不同組織器官(肌肉、肝胰腺和蟹腮)隨暴露濃度的變化特征及其富集動力學參數，以系統地認識其動力學特性，為海洋環境質量評價和生態風險評估提供參考，同時也可為青蟹安全生產提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

2019年5月擬穴青蟹采自上海市東方國際水產市場，其產地為廣西南寧合浦縣山口鎮養殖場，數量200只，體重(150±13.7) g，殼長(95±4.8) mm，殼寬(75±3.7) mm。實驗前暫養一周，保持充氧，每天投喂新鮮花蛤，挑選健康的擬穴青蟹為實驗生物。

1.1.2 實驗用水及容器

海水晶(上海保嘉工貿有限公司)，按比例配制鹽度25‰±0.5‰的海水；實驗期間海水平均溫度(21±1) ℃，pH 7.8±0.3，溶解氧>6.0 mg·L-1，As本底值4.07×10-3mg·L-1，Cd本底值9.1×10-5mg·L-1(配制重金屬暴露濃度過程中扣除本底值)。實驗在120 L的長方體水族箱中進行，使用之前充分清洗消毒。

1.1.3 試劑與儀器

1 000 μg·L-1As(Ⅴ)標準溶液(GR)購自美國Inorganic Ventures公司；氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)(AR)購自中國上海化工試劑廠，用去離子水配成Cd濃度為1 000 μg·L-1的儲備液，稀釋成實驗所需要的濃度梯度；硝酸(AR)購自中國國藥集團化學試劑有限公司。

Agilent 7500型電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)購自美國Agilent公司；Ethos 1/A微波消解儀購自意大利Milestone公司；Element DDS-307型Milli-Q超純水處理系統購自美國Millipore公司；MIK-PH3.0型精密pH計購自上海偉業儀器公司；BSA224S-CW型精密電子天平購自德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 暴露溶液的濃度梯度設定

暴露溶液由1.1.2中的新鮮配制的海水和As、Cd儲備液(質量濃度為1 000 μg·L-1)混合而成。分別設置低、中和高濃度3個實驗組，每組3個平行，另外設置1組海水對照組，每組容器放入15只青蟹。根據《污水綜合排放標準》(GB 8978—1996)規定[18]，As和Cd最高允許排放濃度分別為0.5 mg·L-1和0.1 mg·L-1，以《中華人民共和國漁業水質標準》(GB 11607—1989)[19]對As和Cd濃度的規定為參考，漁業用水中As和Cd應分別低于0.05 mg·L-1和0.0005 mg·L-1。設計As的暴露濃度分別為5、20和100 μg·L-1，Cd的暴露濃度分別為1、5和50 μg·L-1。暴露實驗海水按以上方法配制完成后，對配制的實驗海水中As和Cd濃度進行測定，測得的實際濃度值與設計濃度一致后，用于暴露實驗。實驗期間，海水樣品的采集均在次日換水前進行，采集完海水樣品，立刻檢測其As和Cd的濃度，保證水環境中重金屬暴露濃度的穩定。

1.2.2 As和Cd的富集與釋放實驗

實驗分為富集(15 d)和釋放(15 d)兩部分，整個實驗過程持續30 d。富集實驗加入含有不同重金屬濃度的海水，海水量為100 L，在富集實驗第0、2、3、5、10和15天從各箱中取出青蟹3只，分別取青蟹的肝胰腺、肌肉(包括胸肌和腿肌)和蟹腮3個部分的組織器官制樣，于-40 ℃冰箱中迅速冷凍。富集階段結束后，將各實驗箱中溶液換成100 L清潔海水，分別于第18、20、25和30天采集青蟹樣品，處理方式同富集實驗。每24小時100%更換一次實驗海水。實驗期間每個水槽持續充氧，以保持實驗期間水體中溶解氧含量充足(溶氧量>6 mg·L-1)和水體重金屬的濃度分布均勻。實驗過程中每天投喂新鮮花蛤2次，在早上8:00與晚上18:00投喂。每天第一次投喂前先將實驗缸內的海水排盡并更換上相同濃度新配制的實驗海水以保證實驗期間海水中重金屬濃度的穩定。

1.3 樣品處理與分析

取出擬穴青蟹先稱重，將蟹殼去掉，取出蟹腮、肝胰腺，刮出四肢、螯足腿部肌肉及胸肌混合，最終得到擬穴青蟹的蟹腮、肝胰腺和肌肉3個部分組織器官樣品。同一暴露濃度下，擬穴青蟹的同一組織器官樣品合并為一組，袋裝冷凍保存，待檢測。

樣品前處理使用微波消解法。準確稱量待測樣品1.0 g于聚四氟乙烯消化罐中，加入5 mL硝酸，加蓋密封后置于微波消解儀中，設定消解步驟(功率1 800 W，0～15 min升溫至180 ℃，15～45 min維持180 ℃)。消解完畢后，消解溶液定容到100 mL，同時做空白實驗。

按照《食品安全國家標準 食品中多元素含量的測定》(GB 5009.268—2016)的方法測定[20]。ICP-MS儀器條件：RF射頻功率1 500 W，等離子體氣流量15 L·min-1，載氣為高純氬氣，載氣流速為1.08 L·min-1，輔助氣流量0.4 L·min-1，霧化器為同心霧化器，霧化室溫度2 ℃，采集深度為8 mm，樣品提升速率0.3 r·s-1，碰撞反應氣為高純氦氣，流速4～5 mL·min-1。

1.4 半靜態雙箱模型

半靜態雙箱動力學模型認為重金屬污染物在生物體內的富集可近似看作是污染物在生物體和水體之間的兩相分配過程，其富集、釋放過程可用一級動力學過程描述(圖1)[21]。

圖1 生物富集雙箱動力學模型Fig. 1 Two-compartment kinetic model of bioconcentration

重金屬在生物體內的富集和釋放過程，在毒理動力學的研究中采用雙箱動力學模型與一級動力學方程來評價，其中，含有重金屬污染物的水體作為第一相，生物體作為第二相。那么，重金屬濃度的變化過程如下。

(1)

(2)

式中：t為實驗進行的時間(d)；k1為生物對重金屬的吸收速率常數；k2為生物對重金屬的釋放速率常數；kV為揮發速率常數；kM為生物體的代謝速率常數；cW為水相中As、Cd質量濃度(mg·L-1)；cA為生物體內As、Cd質量濃度(mg·kg-1)。

由于生物富集與釋放實驗時間較短，且重金屬As、Cd難以揮發，因此，可以忽略水相中重金屬污染物的自然揮發及生物體的代謝，即假設kV和kM均為零，由式(1)和式(2)推導可得：

富集過程(0

(3)

釋放過程(t>t*)：cA=cWk1/k2(ek2(t-t*)-ek2t)

(4)

式中：c0為實驗開始前生物體中的As、Cd質量濃度(mg·kg-1)；t*為富集階段結束時實驗進行的時間(d)。由富集實驗和釋放實驗中生物體內重金屬濃度的監測結果，通過非線性擬合得到重金屬的k1和k2。

理論平衡狀態下，生物富集系數(BCF)用式(5)求得；重金屬的生物學半衰期(T1/2)指的是生物體內的重金屬釋放一半所需的時間，用式(6)求得：

BCF =k1/k2= lim(cA/cW) (t→∞)

(5)

T1/2= ln2/k2

(6)

當富集達到理論平衡時，生物體內重金屬濃度(cAmax)由式(7)求得：

cAmax= BCF×cW

(7)

雙箱動力學模型優勢在于即使生物富集沒有達到平衡狀態，也可以用來推斷計算理論平衡狀態下的重金屬動力學參數。該模型目前在研究水體重金屬的富集中應用廣泛，也較為成熟[22]。

1.5 模型的擬合優度檢驗

應用擬合軟件Origin 9.0對數據進行非線性擬合，根據式(3)和式(4)得到k1和k2，結合判定系數(r2)來評價該模型的擬合優度，并采用F檢驗對模型整體的顯著性進行檢驗，以此驗證雙箱模型用于擬穴青蟹對As和Cd的生物富集研究的可行性。采用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行配對t檢驗，當P<0.05時，差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 水中As和Cd的濃度測定

各實驗組海水中As和Cd的質量濃度如圖2所示，實測暴露濃度值在誤差允許范圍內波動，對實驗影響可忽略不計。

圖2 各實驗組水中As和Cd的濃度(0～30 d)Fig. 2 As and Cd concentration of water in each experimental group (0～30 d)

2.2 青蟹不同組織器官對不同濃度As的富集與釋放特性

由圖3～圖5可知，擬穴青蟹暴露在含As濃度為5、20和100 μg·L-1的水體環境中，暴露15 d后，As在青蟹體內尚未達到富集平衡狀態，除5 μg·L-1As暴露組中，肌肉組織對As富集沒有呈現顯著規律性外，其他各實驗組的組織器官中As濃度相對其初始值都表現出明顯的上升趨勢。在富集的第15天，各組織器官中As濃度達到最大，其中，肝胰腺組織中As的富集速度最快，濃度最高。對圖3～圖5中的數據進行方差分析，選擇水相中As濃度作為分類變量，結果表明，除了5 μg·L-1As實驗組中肌肉的As濃度無顯著性差異(P>0.05)外，其他實驗組中肌肉、肝胰腺和蟹腮的As濃度均有顯著性差異(P<0.05)。因此，水相中的As濃度與擬穴青蟹不同組織器官中的As濃度表現出正相關。同一暴露濃度下，各組織器官中As濃度呈現出肝胰腺>蟹腮>肌肉的富集趨勢。在釋放階段，各組織器官中As的濃度隨著釋放時間的延長而減小，表現出明顯的釋放過程。

圖3 擬穴青蟹肌肉組織對As的生物富集和釋放曲線Fig. 3 The bioconcentration and bioelimination curve of As in the muscle tissues of Scylla paramamosain

圖4 擬穴青蟹肝胰腺組織對As的生物富集和釋放曲線Fig. 4 The bioconcentration and bioelimination curve of As in the hepatopancreas tissues of Scylla paramamosain

圖5 擬穴青蟹蟹腮組織對As的生物富集和釋放曲線Fig. 5 The bioconcentration and bioelimination curve of As in the gill tissues of Scylla paramamosain

2.3 青蟹不同組織器官對不同濃度Cd的富集與釋放特性

與As類似，各實驗組對Cd的吸收也尚未達到富集平衡狀態，Cd暴露濃度為1、5和50 μg·L-1，擬穴青蟹肌肉、肝胰腺和蟹腮均對水相中的Cd具有明顯的吸收，Cd濃度明顯增加。在富集的第15天，各實驗組中的Cd濃度均到達到最高。對圖6和圖7中的數據進行方差分析，選擇水相中Cd濃度作為分類變量，結果顯示，擬穴青蟹肌肉、肝胰腺和蟹腮的Cd濃度均有顯著性差異(P<0.05)。因此，水相中的Cd濃度與擬穴青蟹不同組織器官中的Cd濃度表現出正相關。在同一暴露濃度下，3個組織器官中Cd濃度同樣也呈現出肝胰腺>蟹腮>肌肉的富集趨勢。在釋放階段，各個器官中Cd的濃度隨著釋放時間的增加而減小，表現出明顯的釋放過程。擬穴青蟹組織器官中重金屬的濃度不僅與富集的時間成正相關，也與水相中重金屬的濃度呈現濃度-效應關系。

2.4 擬穴青蟹對As和Cd的生物富集動力學參數

由非線性擬合得到k1和k2，再根據式(5)、式(6)和式(7)得到擬穴青蟹對As和Cd生物富集動力學參數BCF、cAmax和T1/2。擬穴青蟹不同組織器官對As和Cd的富集動力學參數如表1所示。

圖6 擬穴青蟹肌肉組織對Cd的生物富集和釋放曲線Fig. 6 The bioconcentration and bioelimination curve of Cd in the muscle tissues of Scylla paramamosain

圖7 擬穴青蟹肝胰腺組織對Cd的生物富集和釋放曲線Fig. 7 The bioconcentration and bioelimination curve of Cd in the hepatopancreas tissues of Scylla paramamosain

圖8 擬穴青蟹蟹腮組織對Cd的生物富集和釋放曲線Fig. 8 The bioconcentration and bioelimination curve of Cd in the gill tissues of Scylla paramamosain

2.5 模型的擬合優度檢驗

由表2可知，擬穴青蟹各組織器官對As和Cd生物動力學擬合曲線判定系數(r2)范圍分別為0.885～0.985和0.915～0.972，F檢驗的P值均<0.05，表明模型擬合程度較好且回歸方程是顯著的。在該模型是顯著的基礎上，利用模型計算擬穴青蟹體內重金屬As和Cd的擬合濃度，與實測值進行配對t檢驗，得到的P值均>0.05，說明模型擬合輸出值和實測值之間不存在顯著差異性，擬合方程和擬合參數可信，由此驗證本實驗條件下雙箱動力學模型是可信的。

3 討論(Discussion)

擬穴青蟹對As和Cd的富集參數在不同組織器官存在特異性。由表1可知，各組織器官對As的富集參數k1和BCF均表現為肝胰腺>蟹腮>肌肉，且均為顯著相關(P<0.05)，理論平衡狀態下各組織器官中cAmax值隨著水中As濃度升高而增大。k2值較小，k2與T1/2在3種組織器官中沒有顯著差異(P>0.05)。同樣，各組織器官對Cd的富集參數k1和BCF均表現為肝胰腺>蟹腮>肌肉，且均為顯著相關(P<0.05)，理論平衡狀態下Cd的cAmax值隨著水中Cd濃度升高而增大。但k2與T1/2無顯著差異(P>0.05)。重金屬As和Cd在擬穴青蟹體內的富集具有組織特異性，這可能與不同組織器官的生理功能和代謝水平有關。肝胰腺是水生生物的主要解毒和排泄器官，可以快速大量合成金屬硫蛋白(MT)而使重金屬得以大量蓄積，對重金屬的富集能力明顯高于肌肉等部位[23]。鰓是許多水生生物的呼吸器官，其表面積大，結合位點多，重金屬進入生物體內首先在腮表面附著，通過結合位點進入體內，因此腮也可以使重金屬大量積累[24]。本研究中，肌肉組織在As的暴露濃度為5 μg·L-1時無富集規律，可能是由于As的濃度較低，富集量少，As被攝入生物后先經過肝胰腺等器官，當該部位發生過度積累后才會加快向肌肉組織轉移，所以肌肉未表現出明顯的富集特征。有關組織蓄積特異性的相似報道也出現在克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[25]、日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)[22]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[26]和菲律賓花蛤(Ruditapesphilippinarum)[27]等水生生物中。

表1 擬穴青蟹各組織器官對不同濃度As和Cd的生物富集動力學參數Table 1 The kinetic parameters of bioconcentration of As and Cd by different tissues and organs of Scylla paramamosain in the different concentration of As and Cd

同一暴露濃度下，擬穴青蟹各組織器官對Cd和As的富集速率不同。在As和Cd暴露濃度相同的條件下(5 μg·L-1)，k1和BCF值在肝胰腺和蟹腮中均呈現出Cd>As(P<0.05)，表明對Cd富集能力大于As，其中，As在肝胰腺的BCF為158.2，在蟹腮中的BCF為95.53；Cd在肝胰腺的BCF為1 738，在蟹腮中的BCF為603.8，表明As和Cd在擬穴青蟹的這2個組織器官中具有很強的富集性，而在肌肉中的富集系數相對較小。但擬穴青蟹各組織器官對As和Cd的k2值無顯著差異(P>0.05)。生物體對Cd的富集能力強于As也在其他生物暴露實驗中被發現。牡蠣(OstreagigasThunberg)對重金屬As和Cd在不同暴露濃度下的BCF分別為48.98～56.67和880.6～986.3，表明牡蠣對Cd表現出更強的富集能力[28]。魁蚶(Scapharcabroughtonii)在As暴露濃度為30 μg·L-1和Cd暴露濃度為5 μg·L-1時得到的BCF分別為38.97和1 566.80，表明Cd的富集能力強于As[29]。各組織器官對Cd表現出比As更強的富集能力，可能是Cd是以Cd(Ⅱ)形態進入生物體，而MT是一種富含巰基的金屬結合蛋白，大量巰基對二價金屬離子尤其重金屬離子具有極高的親和力，能與非必需有毒金屬(Cd(Ⅱ))結合，這可以保護細胞器免受損傷，這種結合反應主要存在于生物體的肝臟和腸道中[23]。

表2 擬穴青蟹各組織器官對As和Cd生物富集雙箱動力學模型的擬合優度檢驗Table 2 Goodness of fit test of two-compartment kinetic model applied in the As and Cd bioaccumulation in the different tissues and organs of Scylla paramamosain

As和Cd在擬穴青蟹各組織器官的BCF呈規律性的變化特征，即BCF隨水相暴露濃度的增加而減少。海洋生物對重金屬的富集實際上取決于重金屬進出生物體的速率，相對的速率變化決定了生物對重金屬的富集能力[30]。因此，在實驗初期，在低濃度暴露時，擬穴青蟹體內重金屬濃度較低，生物體開始大量吸收重金屬，重金屬主要從水相向生物體相遷移，此時k1>k2。經過一段時間富集后，擬穴青蟹對重金屬的吸收速率趨于平穩狀態，富集增加幅度減小，吸收和釋放2個過程逐漸趨于平緩，富集曲線也趨于平緩。同時，增大的重金屬濃度更加接近擬穴青蟹的毒性效應閾值，因此，高暴露濃度下的代謝能力弱于低暴露濃度，最終表現為低濃度條件下的BCF比高濃度下的BCF值高。相同的規律也在翡翠貽貝(Pernaviridis)[31]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[32]和櫛孔扇貝(Azumapectenfarreri)[33]對重金屬的富集研究中被發現。此外，海洋生物對有機污染物(苯并[a]芘和苯酚等)的生物富集中也有此現象，具有一定的普遍性[34-35]。本文研究了不同濃度As和Cd在擬穴青蟹中的富集與釋放特征，通過雙箱動力學模型得到了可供參考的BCF、cAmax和T1/2等生物富集動力學參數值，進一步推進了重金屬在蟹體中的分布、生物傳遞和蓄積特征的研究。