Er(Ⅲ)對油菜線粒體的作用

汪冬芳，江博，閆寶亨，劉瑞強，周琴，李大彬，戴捷，*

1. 長江大學化學與環境工程學院，荊州 434023 2. 湖北省生態環境廳荊州生態環境監測中心，荊州 434000

稀土元素因其獨特的理化特征，而廣泛應用于農業、電子、鋼鐵和醫藥等領域[1]。研究表明，較低濃度的稀土元素能夠促進種子發芽，刺激植物根部生長，提高農作物的抗性，進而提高農作物產量，而高濃度稀土離子將對農作物生長產生抑制作用[2-3]。隨著環境污染的日趨嚴重以及稀土微肥的廣泛使用，土壤中稀土離子含量不斷提高，對植物產生毒害作用，并通過食物鏈進入人體，對人類健康構成威脅，因此有必要探究稀土元素對植物的影響[4]。

線粒體是細胞進行的有氧呼吸場所，為細胞的各項生命活動提供能量。此外，線粒體還可調控細胞程序化死亡，對細胞代謝產生重要影響[5]。研究表明，鑭、鈰和釓等稀土離子對水稻離體線粒體代謝及呼吸功能表現出抑制作用，高濃度稀土甚至導致線粒體內膜破裂[6]；Dai等[7]的研究表明，稀土鑭和鈰在低濃度時經體內途徑對水稻線粒體代謝活性有促進作用，但高濃度則產生抑制作用。關于稀土元素對線粒體的影響的研究大多集中于輕稀土和中稀土，而對重稀土的研究工作較少。Li等[8]的研究表明，安徽省土壤中鉺(Er)含量達到了3.88 mg·kg-1，相對其土壤背景值增加了61.6%，較高濃度的Er會對動植物產生不利影響，本研究重點關注Er(Ⅲ)與植物的相互作用。

以油菜線粒體為對象，采用光譜法和Clark氧電極法研究重稀土離子Er(Ⅲ)對線粒體結構與功能的影響，并且采用透射電子顯微鏡(TEM)表征了不同濃度Er(Ⅲ)作用下線粒體的微觀結構。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

BPN-50CH(UV)恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司，中國)；TGL-20M高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，中國)；UV-6100S雙光束紫外-可見分光光度計(上海美普達儀器有限公司，中國)；LS-55熒光光度計(Perkin Elmer，美國)；Clark溶氧電極系統(Pnsatech Instruments Ltd.，英國)；移液器(Eppendorf，德國；BioHit，芬蘭)；Sartorius普及型pH計(Sartorius，德國)；微量進樣器(海高鴿工貿有限公司，中國)；JEM-100CXⅡ透射電子顯微鏡(日本電子公司)等。

蔗糖、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、L-半胱氨酸、三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、甘露醇、六水合氯化鎂、磷酸二氫鉀、六水合丁二酸鈉、乙酸鉀、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、硝酸鉀、氯化鉀、β-巰基乙醇、六水合氯化鉺、牛血清白蛋白(BSA)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPs)魚藤酮、纈氨霉素、二磷酸腺苷(ADP)和血卟啉(HP)等購自國藥集團化學試劑有限公司。

研磨緩沖液(pH=7.5)：0.5 mol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl、5 mmol·L-1EDTA、0.1% BSA和5 mmol·L-1β-巰基乙醇。洗滌緩沖液(pH=7.5)：0.5 mol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl和10 mmol·L-1MgCl2溶液。懸浮緩沖液(pH=7.5)：0.6 mol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1Tris-HCl和20 mmol·L-1EDTA。Buffer C (pH=7.5)：250 mmol·L-1蔗糖、20 mmol·L-1HEPES、2 mmol·L-1MgCl2、5 mmol·L-1KH2PO4、20 mmol·L-1丁二酸鈉和1 μmol·L-1魚藤酮。呼吸耗氧溶液(pH=7.5)：100 mmol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1Tris、10 mmol·L-1MOPs、1 mmol·L-1Na2EDTA、2 mmol·L-1MgCl2、50 mmol·L-1KH2PO4和4 μmol·L-1魚藤酮。H+滲透性溶液：135 mmol·L-1乙酸鉀、5 mmol·L-1HEPES、0.1 mmol·L-1EGTA、0.2 mmol·L-1Na2EDTA、1 μg·mL-1纈氨霉素和2 μmol·L-1魚藤酮，溶液調至pH=7.1。K+滲透性溶液：13.5 mmol·L-1KNO3、5 mmol·L-1HEPES、0.1 mmol·L-1EGTA、0.2 mmol·L-1Na2EDTA和2 μmol·L-1魚藤酮，溶液調至pH=7.1。以上溶液與Er(Ⅲ)溶液均采用超純水配制。

華油雜62，購于華中農業大學種子直銷公司。

1.2 實驗方法

油菜黃化苗培養：將油菜種子用75%的酒精清洗5～10 s后浸入4% NaClO進行表面消毒5～10 min。已消毒的種子用二次水浸泡10～16 h后置于培養盤中，在22 ℃培養箱中培養15 d，黃化苗長至6～10 cm待用。

油菜線粒體提?。河筒司€粒體的提取方法參照文獻[9-10]的方法。黃化苗加研磨緩沖液在研缽中搗碎后過濾得到線粒體的粗提取液。將粗提取液在3 100 g轉速下離心10 min，隨后將離心所得上清液于17 600 g轉速下再次離心8 min，得到的沉淀為粗線粒體。線粒體純化過程主要是將沉淀懸浮于懸浮緩沖液中，再將其均勻鋪展在洗滌緩沖液中以17 600g離心8 min，此純化步驟重復2次得到的沉淀即為線粒體。

線粒體腫脹度測定：將線粒體均勻分散于2 mL Buffer C中，在常溫條件下，測定線粒體懸浮液于540 nm波長處的吸光度，檢測時間為600 s[11]。

線粒體H+/K+滲透性測定：將線粒體均勻分散于2 mL對應的H+/K+滲透緩沖液中，在常溫條件下，測定線粒體懸浮液于540 nm波長處的吸光度，檢測時間為600 s[12]。

線粒體膜流動性測定：以HP為探針，采用熒光分光光度計測定不同濃度Er(Ⅲ)對線粒體膜流動性的影響[13]：將線粒體均勻分散到含有6 μmol·L-1HP的2 mL Buffer C中，在激發和發射波長分別為520 nm和626 nm條件下測量線粒體懸浮液熒光各向異性(r)。r的定義如方程(1)所示：

r=(I∏-GI⊥)/(I∏+2GI⊥)

(1)

式中：I∏和I⊥表示激發偏振器與發射偏振器取向分別為相互平行和相互垂直時所測得的偏振發射光強度。G=I∏/I⊥，為儀器光柵的修正因子[14]。

Clark氧電極法：采用Clark氧電極測定不同濃度Er(Ⅲ)作用下線粒體的呼吸耗氧情況。將4 mg·mL-1的線粒體溶解于1 mL的呼吸耗氧溶液中，以5 mmol·L-1丁二酸鈉與0.25 mmol·L-1ADP作為呼吸底物，在37 ℃下恒溫培養，測定線粒體呼吸狀態3(state 3)下的耗氧速率[15]。

TEM表征線粒體超微結構：將含不同濃度Er(Ⅲ)的線粒體在戊二醛/磷酸鹽緩沖液中固定30 min后，用磷酸鹽緩沖液清洗3次并固定于1%的四氧化鋨溶液，經脫水、超薄切片和染色處理后，用TEM表征線粒體形貌[16]。

2 結果(Results)

2.1 Er(Ⅲ)誘導線粒體腫脹

采用紫外-分光光度計測定了不同Er(Ⅲ)濃度下線粒體在540 nm處吸光度，吸光度降低則說明線粒體腫脹[17]。結果如圖1所示，不同濃度的Er(Ⅲ)均引起了吸光度不同程度的降低，當Er(Ⅲ)濃度為0～100 μmol·L-1時，吸光度下降程度較小，腫脹程度并不明顯；隨著Er(Ⅲ)濃度的增大，線粒體腫脹現象越來越明顯，當Er(Ⅲ)濃度達到600 μmol·L-1時，吸光度迅速下降至0.32，說明此時線粒體的腫脹現象非常明顯。

圖1 不同濃度鉺離子(Er(Ⅲ))引起油菜離體線粒體腫脹注：a～f表示Er(Ⅲ)濃度分別為0、50、100、200、400和600 μmol·L-1。Fig. 1 Swelling of isolated rape mitochondria caused by different concentrations of erbium (Er(Ⅲ))Note: a～f represent concentrations of Er(Ⅲ) are 0, 50, 100, 200, 400 and 600 μmol·L-1.

2.2 Er(Ⅲ)對線粒體膜H+/K+滲透性的影響

Er(Ⅲ)對線粒體內膜H+/K+滲透性的影響均通過去能的線粒體腫脹程度判斷。如圖2(a)所示，隨著Er(Ⅲ)的加入，吸光度下降，線粒體出現了纈氨霉素依賴性的腫脹，這說明Er(Ⅲ)促進了線粒體內膜對H+的滲透作用。如圖2(b)所示，隨著Er(Ⅲ)濃度的增加，540 nm處吸光度迅速降低，線粒體逐漸膨脹，說明Er(Ⅲ)促進了線粒體內膜對K+的滲透。

圖2 不同濃度Er(Ⅲ)對于線粒體內膜H+(a)/K+(b)滲透的影響注：a～f表示Er(Ⅲ)濃度分別為0、50、100、200、400和600 μmol·L-1。Fig. 2 Mitochondrial inner membrane permeabilization to H+(a)/K+(b) influenced by different concentrations of Er(Ⅲ)Note: a～f represent concentrations of Er(Ⅲ) are 0, 50, 100, 200, 400 and 600 μmol·L-1.

2.3 Er(Ⅲ)對線粒體膜流動性的影響

線粒體的腫脹通常伴隨著線粒體膜流動性的改變，為此檢測了不同濃度Er(Ⅲ)作用后的線粒體結合HP的熒光各向異性，熒光各向異性增大表明膜流動性降低[18]。如圖3所示，隨著Er(Ⅲ)濃度的增大，線粒體熒光各向異性逐漸增大，說明Er(Ⅲ)降低了線粒體膜的流動性。尤其是當Er(Ⅲ)濃度超過50 μmol·L-1后，線粒體的熒光各向異性明顯增大，說明高濃度Er(Ⅲ)會明顯降低線粒體膜的流動性。

圖3 不同濃度Er(Ⅲ)引起線粒體膜流動性的改變注：a～f表示Er(Ⅲ)濃度分別為0、50、100、200、400和600 μmol·L-1。Fig. 3 Changes of mitochondrial membrane fluidity caused by different concentrations of Er(Ⅲ)Note: a～f represent concentrations of Er(Ⅲ) are 0, 50, 100, 200, 400 and 600 μmol·L-1.

2.4 Er(Ⅲ)對線粒體呼吸作用的影響

采用Clark氧電極法考察了Er(Ⅲ)對線粒體第3階段(State 3)呼吸作用的影響。由圖4可知，隨著Er(Ⅲ)濃度逐漸增大，線粒體呼吸耗氧速率逐漸下降，這說明線粒體呼吸作用減弱，Er(Ⅲ)抑制了線粒體呼吸鏈的功能。

圖4 Er(Ⅲ)對于油菜離體線粒體State 3下呼吸速率的影響注：數字表示加入相應濃度的Er(Ⅲ)后的耗氧率。Fig. 4 Effect of Er(Ⅲ) on the State 3 respiration rate of isolated rape mitochondriaNote: The number indicates oxygen consumption rate after adding corresponding concentration of Er(Ⅲ).

2.5 線粒體TEM圖譜

TEM表征線粒體超薄切片的圖譜如圖5所示。由圖5(a)可知，線粒體外膜完整，呈橢圓形，電子密度高，部分區域可以觀察到緊湊的嵴。由圖5(b)可知，100 μmol·L-1Er(Ⅲ)溫育后的線粒體電子密度明顯變低，線粒體體積變大，嵴已經很難辨認，這與線粒體發生腫脹的實驗結果相符。由圖5(c)可知，為500 μmol·L-1Er(Ⅲ)溫育后的線粒體外膜有一定程度破壞。研究表明，線粒體可通過線粒體孔道釋放細胞色素c調控細胞死亡，當線粒體外膜受損，線粒體內的細胞色素c釋放過多，將導致細胞死亡[19]。

圖5 0 μmol·L-1 (a)、100 μmol·L-1 (b)和500 μmol·L-1 (c) Er(Ⅲ)溫育的線粒體超微結構的TEM表征Fig. 5 TEM images of the ultra-structure of mitochondria incubated with Er(Ⅲ) of 0 μmol·L-1 (a), 100 μmol·L-1 (b) and 500 μmol·L-1 (c)

3 討論(Discussion)

線粒體懸浮液在540 nm處的吸光度變化可以表征Er(Ⅲ)對線粒體腫脹程度的影響，吸光度下降表明線粒體腫脹。研究表明，Er(Ⅲ)濃度的增加引起了吸光度不同程度的降低，說明線粒體基質擴張，線粒體腫脹。在較高濃度Er(Ⅲ)誘導下，線粒體內膜的通透性增大，大量溶質進入線粒體基質，膠體滲透壓增加，線粒體發生腫脹，這可能會進一步導致線粒體外膜破損。

當線粒體基質體積變大時，內膜嵴展開，部分蛋白的構象可能會發生變化，導致膜流動性變化[22]。有報道稱，HP會集中在內膜上的特殊極性及蛋白區域，通過HP標記線粒體，測量其熒光各向異性變化可反映線粒體膜流動性的改變。如圖3所示，熒光各向異性的變化表明，隨Er(Ⅲ)濃度增加，線粒體膜的流動性降低，說明線粒體內膜上的部分蛋白質發生變化，這可能會造成線粒體功能紊亂。

以上研究結果表明，Er(Ⅲ)誘導線粒體發生了膜滲透性轉化(MPT)，TEM圖譜觀察到在較高濃度Er(Ⅲ)作用下，線粒體外膜明顯受損，這進一步驗證了MPT的發生。MPT會引起線粒體正常功能出現異常，而線粒體最重要的功能之一是通過呼吸作用為細胞供能。State 3下，線粒體通過電子傳遞鏈和ATP合成酶，將ADP合成為ATP，這個過程主要受到呼吸鏈和ATP合成酶的控制。Clark氧電極實驗結果表明，較高濃度的Er(Ⅲ)會抑制線粒體呼吸作用，影響線粒體呼吸鏈功能，破壞了線粒體功能。本研究結果證實，較高濃度的Er(Ⅲ)對于油菜線粒體的結構與功能均具有破壞作用。