人參皂苷Rg5調控lncRNA-PCAT12抑制胃癌細胞生長實驗研究*

卓少華，丘遠聰，鄭俊德，殷 蕾，王惠穎

1.廣東省惠州市第一人民醫院藥學部(惠州 516003)；2.惠州衛生職業技術學院(惠州 516001)； 3.廣東省蕉嶺縣人民醫院(蕉嶺 514100)

胃癌是一種常見癌癥，每年有738 000多人死于胃癌，并且全球有一半的胃癌患者發生在我國[1-2]。目前，已經有多種治療策略可用于治療胃癌患者，例如使用化學療法、放射療法或兩者結合。盡管早期胃癌的治療已有進展，但預后仍然很差，并且有很多患者死于胃癌復發[3]。

近年來，天然產物化合物由于其有顯著的抗癌效果和較小的副作用，已經引起了腫瘤研究工作者的極大興趣[4]。人參皂苷Rg5是一種從人參中提取出來的二醇類三萜皂苷，具有誘導細胞凋亡、增殖和遷移的能力[5-6]。其中Rg5表現出對腫瘤細胞增殖、轉移的抑制，并且能誘導腫瘤細胞凋亡。非編碼lncRNA-PCAT12 (lncRNA-PCAT12)是一種長度≥200 nt的RNA，在腫瘤細胞增殖與遷移過程中扮演重要角色[7]。研究發現lncRNA-PCAT12參與胃癌細胞浸潤、轉移過程，但是鮮有報道關于其作用的具體機制[8-9]。此次研究是為了進一步探究人參皂苷Rg5通過調控lncRNA-PCAT12表達，從而抑制胃癌細胞生長的藥用意義。

材料與方法

1 材 料 從中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心)采購人胃癌細胞株SNU-1細胞；從奧貝樂生物科技公司購買人參皂苷Rg5；從廣州生物碩恒科技有限公司購買胎牛血清和RPMI-1640培養基;從南京卡米洛生物工程有限公司購買Annexin V FITC/PI細胞凋亡試劑盒。

2 細胞分組與處理 在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養人胃癌細胞SNU-1，培養箱參數設為37 ℃，5% CO2。對各組細胞分組處理，空白組加入DMEM培養基8 ml，人參皂苷Rg5低、中、高濃度組分別加入含人參皂苷Rg5 0.03，0.06，0.09 μmol/L的DMEM培養基8 ml(A組、B組、C組)，對照組不做處理。

3 采用MTT法檢測細胞增殖 藥物處理細胞時間節點設為24、48、72 h，每次時間處理完成后，把各組細胞種植在96 孔板中，種植密度設為6 ×103個細胞/孔。接著在每一孔中加入28 μl 0.5 mg /ml MTT溶液，然后連續培養6 h，再加入DMSO。培養完成后，震蕩8 min，于530 nm波長處用酶標儀檢測光密度值，從而得到增殖活性。

4 采用Annexin-FITC雙染法檢測細胞凋亡 藥物處理細胞時間節點設為24 、48和72 h，將各組細胞種在6孔培養板，細胞密度設置為6×105/ml。在各組細胞中取出200 μl細胞懸液，按照順序依次加入10 μl Annexin-FITC和10μl PI錠(濃度為20 μg /ml)，然后重懸細胞，使用流式細胞儀測出各組細胞的凋亡率。

5 采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 對各組細胞處理48 h后，將各組細胞種在6孔培養板(106個/孔)，然后放置在培養箱中培養過夜(37 °C，5% CO2)。使用無菌槍頭在培養皿中均勻劃痕，然后使用PBS(1×)洗滌細胞4次，將各組細胞加入培養基后拍照記錄，此時定義時間為0 h時各組細胞的遷移狀況。繼續放置在培養箱中，24 h后顯微鏡下觀察并且拍照記錄，求出兩次記錄間的劃痕距離，即認為是相應組別細胞的遷移能力。

6 采用RT-PCR檢測lncRNA-PCAT12表達水平 藥物處理細胞時間節點設為24、48、72 h，每次完成處理后收集各組細胞，使用Trizol法提取總RNA。以β-actin作為內標，采用RT-PCR檢測lncRNA-PCAT12在各組細胞中表達水平。使用引物如表1所示，上述實驗重復6次。

表1 RT-PCR所用引物序列

結 果

1 人參皂苷Rg5抑制lncRNA-PCAT12表達 使用人參皂苷Rg5按不同濃度在不同時間節點處理各組細胞后，實驗組(A組、B組和C組)中lncRNA-PCAT12的表達水平都低于對照組(P<0.05)；C組中lncRNA-PCAT12的表達水平最低，都小于A組和B組(P<0.05)。見表2。

表2 三組處理后不同時間點的lncRNA-PCAT12相對表達量對比

2 人參皂苷Rg5抑制胃癌細胞增殖 處理后24、48、72 h，實驗組(實驗1組、實驗2組和實驗3組)中胃癌細胞的增殖能力都低于對照組(P<0.05)；實驗3組中癌細胞增殖能力最弱，增殖指數均小于實驗1組和實驗2組(P<0.05)，見表3。

表3 三組處理后不同時間點的細胞增殖指數對比(%)

3 人參皂苷Rg5促進胃癌細胞凋亡 在使用不同濃度人參皂苷Rg5處理各組胃癌細胞24、48、72 h后，檢測各組細胞凋亡率。實驗組(A組、B組和C組)細胞凋亡率高于對照組(P<0.05)，C組中細胞凋亡率最高，均高于A組和B組(P<0.05)。見表4。

4 人參皂苷Rg5抑制胃癌細胞遷移 細胞劃痕實驗結果顯示，實驗組(C組、B組和A組)遷移距離均小于對照組(90.53±5.61)μm (P<0.05)，C組中細胞遷移距離最短(18.49±1.63)μm，均小于A組(43.60±6.12)μm和C組(22.11±4.29)μm (P<0.05)。

表4 三組處理后不同時間點的細胞凋亡率對比(%)

討 論

目前普遍認為細胞的惡性增殖是癌癥發生的必要環節，近年來對胃癌的研究發現，lncRNA通過調控核心基因的表達量，能顯著抑制癌細胞增殖遷移，并促進其凋亡[10-11]。胃為“氣血生化之源”和“水谷之海”，若長期飲食不節、血瘀內結，可導致脾胃功能失常，導致胃癌的發生[12]。從人參皂苷中可以分離出Rg5，近來研究表明人參皂苷Rg5可顯著抑制癌細胞生長[13]。本研究發現人參皂苷Rg5可顯著抑制胃癌細胞增殖遷移，促進胃癌細胞凋亡，這將為利用人參皂苷Rg5 治療胃癌提供可靠參考。

lncRNA-PCAT12存在于細胞核中，它主要參與染色體修飾、轉錄沉默、轉錄激活等重要生理功能。因為它對疾病的發生、發展及治療有重要作用，人參皂苷Rg5具有非常廣闊的臨床應用前景[14]。科學研究發現，lncRNA-PCAT12在骨肉瘤組織中表達升高，如果對lncRNA-PCAT12進行抑制，癌細胞的增殖和侵襲能力會明顯下降。此外，在胰腺癌中，過表達的lncRNA-PCAT12會激活ATM-E2F1信號通路讓癌細胞的遷移和侵襲能力顯著升高[6]。近期研究表明，lncRNA-PCAT12在肝癌組織中的表達上調，并且lncRNA-PCAT12的表達水平與肝癌患者不良預后密切相關，但目前關于其在胃癌中參與的分子機制、藥物敏感性卻鮮有探究[15]。本研究顯示，處理后24、48、72 h，對照組中lncRNA-PCAT12的表達水平、細胞增殖指數都高于實驗組，而C組是各組中胃癌細胞受抑制最明顯的實驗組，說明人參皂苷Rg5能抑制胃癌細胞增殖，而且抑制能力與使用人參皂苷Rg5的劑量顯著相關。

總之，本次實驗發現了人參皂苷Rg5能通過調控lncRNA-PCAT12的表達抑制胃癌細胞增殖遷移，促進胃癌細胞凋亡，這為治療胃癌提供了新的藥物選擇。