四君子加川牛膝方對大鼠下肢難愈性創面血小板衍化生長因子表達的影響*

王 鵬，劉 欣，郭樹豫，王云飛△

1.上海交通大學附屬仁濟醫院南院血管外科(上海 200000)；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院中醫外科(上海 200032)

難愈性創面是外科的常見病，占外科總住院人數1.5%～3%[1-2]，中醫藥促進創面愈合具有悠久的歷史，龍華醫院顧氏外科早在上世紀七八十年代，就開始了對慢性難愈性創面的臨床[3-4]及實驗[5-7]研究，相關研究發現中醫藥可以有效促進創面愈合，對難愈性創面有良好的療效。我們運用“四君子加川牛膝方”治療下肢創面取得了一定的治療效果[8-9]，并開展了相應的機制研究，進一步探討其促進難愈性創面愈合的機制。

材料與方法

1 實驗動物 實驗動物取雄性SD(Sprague-Dawly)大鼠，SPF級別，64只，平均體質量為(234.05±26.91)g，均為12周齡。該實驗動物由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。許可證號(實驗動物)：SCXK(滬)2008-0016。

2 主要試劑及儀器 本研究參考《太平惠民和劑局方》中“四君子湯”，由黨參、茯苓、白術各9 g，甘草6 g組成。該中藥委托本院制劑室制備。中藥按照傳統工藝制成水煎劑，依據《中藥藥理研究方法學》進行人鼠等效劑量換算，為2.97 g/kg。同時將水煎劑進行減壓濃縮，濃度為0.30 g/ml。而四君子加川牛膝方，則由黨參、茯苓、白術各9 g，川牛膝30 g，甘草6 g組成，換算人鼠等效劑量是5.67 g/kg，減壓濃縮至0.57 g/ml。川牛膝方是由川牛膝30 g組成的，人鼠等效劑量是2.7 g/kg，減壓濃縮至0.27 g/ml。戊巴比妥鈉(Sigma公司，批號為20100312)；大鼠血小板衍化生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)的ELISA試劑盒，批號201501231，來源上海西唐生物。檸檬酸鈉緩沖溶液，批號BYL40864，來源上海基爾頓公司；PBS，批號BYL40657，來源上海基爾頓公司；二甲苯，批號10023418，來源上海國藥集團；蘇木精，批號H8070-5，來源上海索萊寶生物。胎牛血清，批號10099-141，來源Gibco；0.25%胰蛋白酶，批號BYL40926，來源上海基爾頓公司；BCA蛋白定量試劑盒，批號PICPI23223，來源thermo；蛋白預染Marker，批號SM1811，來源Fermentas；NC膜，批號HATF00010，來源millipore；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，批號G2003，來源于谷歌生物。

芬蘭雷勃酶標儀，型號MK3；微量高速離心機(國產)；吉爾森P型移液器(Pipetman)；隔水式恒溫培養箱(國產)；Leica(萊卡公司)水浴鍋，型號HI1210；吉爾森P型移液器(Pipetman)，型號 P20。

3 實驗方法 參照文獻[10-11]進行動物造模，實驗前12 h開始對實驗大鼠進行禁食，但給予定量飲水。實驗當天測量大鼠體重，單次腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液進行實驗動物的麻醉(麻醉劑量按40 mg/kg體質量換算)。麻醉滿意后，完成大鼠造模區備皮及標記，予電推剪于右側臀腿部位剃毛，并用直徑25 mm的塑料瓶蓋局部標記。在無菌條件下用手術剪沿標記在備皮部位剪開，做直徑為25 mm的圓形全層皮膚缺損，后腹腔注射氫化可的松琥珀酸鈉(按照80 mg/kg體質量換算)，完成下肢難愈性創面大鼠的動物造模。

4 動物分組、處理及取材 將模型大鼠64只隨機分為四組：四君子湯組、四君子加川牛膝方組、生理鹽水組、川牛膝組，每組均為16只。實驗大鼠分籠單獨飼養。造模后次日灌胃給藥，四組實驗大鼠依次給予四君子湯中藥、四君子加川牛膝方中藥、生理鹽水、川牛膝，每日 1次，每次2 ml。四組實驗大鼠均于造模后，每日1次創面清潔換藥。換藥前1∶5000呋喃西林溶液清潔創面，單層生理鹽水紗布濕敷，兩層無菌干紗布覆蓋，膠布固定。

每組16只動物隨機分成2批。分別于造模后的第7天、第14天進行取材。麻醉方法同上，單次腹腔內注射戊巴比妥鈉(按40 mg/kg換算)。麻醉滿意后，用眼科手術剪取創緣0.5 cm以內少量肉芽組織。立即放入凍存管內，超低溫冰箱保存。同時行腹主動脈抽血，每只大鼠抽取8 ml血液，放入抗凝管，超低溫冰箱保存。

5 PDGF檢測 蒸餾水按1∶10倍將標本稀釋液稀釋。測定前用標本稀釋液按1∶5倍稀釋血清。在使用前，將標準品液加入1 ml蒸餾水混合均勻，配制成20 ng/ml的溶液。取1.5 ml離心管8個，在第一管中加入標本稀釋液900 μl，在第二至第八管中分別加入標本稀釋液500 μl。在第一管中加20 ng/ml的標準品溶液100 μl，后將溶液置于漩渦混合器上，混合均勻，并予加樣器吸出500 μl，將此溶液移至第二管。同法反復進行對倍稀釋，最終從第七管中吸出溶液500 μl棄去。將第八管作為空白對照組。將標準品或待測樣品100 μl依次加入每個孔中，充分混合均勻，37℃下放置40 min。充分洗滌反應板，并在濾紙上印干。將蒸餾水和第一抗體工作液各50 μl加入每個孔中，反應板混勻后，并置37℃ 20 min。充分洗滌反應板5次，濾紙上印干。將酶標抗體工作液100 μl加入每個孔中。將反應板置37℃10 min。再次充分洗滌反應板5次，濾紙印干。每孔分別加入底物工作液100 μl，放置37 ℃暗處進行反應15 min。后每孔加入100 μl終止液，并進行混勻。30 min內通過酶標儀在450 nm處檢測吸光值。將所有的OD值減除空白值之后，再進行計算。將標準品不同濃度作為橫坐標，OD值作為縱坐標，通過軟件作圖，描繪出標準曲線。依據樣品的OD值計算相應PDGF的含量，再乘上稀釋倍數。

6 統計學方法 應用SPSS 17.0統計學軟件。正態分布的數據組間比較采用方差分析，以均數±標準差表示。P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 各組肉芽組織HE染色結果 造模后第7天創面肉芽組織HE染色，生理鹽水組血管生成較少，成纖維細胞較少；四君子加川牛膝方組，血管生成中度，成纖維細胞中度；四君子湯組，成纖維細胞較多；川牛膝組，成纖維細胞較大，新生血管較少(圖1)。

造模后第14天創面肉芽組織HE染色，生理鹽水組新生血管中度，成纖維細胞中度；四君子加川牛膝方組，成纖維細胞中度,新生血管較多；四君子湯組，新生血管中度，成纖維細胞中度；川牛膝組，新生血管較多(圖2)。

A:生理鹽水組；B:四君子加川牛膝方組；C:四君子湯組；D:川牛膝組

A:生理鹽水組；B:四君子加川牛膝方組；C:四君子湯組；D:川牛膝組

2 各組大鼠PDGF濃度比較 見表1。在造模后第7天，四君子湯組、四君子加川牛膝方組與生理鹽水組比較，PDGF表達明顯增高(F=4.30,P<0.05)；川牛膝組與生理鹽水組比較，兩組PDGF無統計學差異(P>0.05)；四君子湯組與四君子加川牛膝方組的PDGF表達無統計學差異(P>0.05)。

造模后第14天，四君子湯組、四君子加川牛膝方組、川牛膝組、生理鹽水組，組間比較，PDGF表達水平無統計學差異(F=0.85，P>0.05)。

表1 各組大鼠PDGF濃度比較(mg/ml)

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05；與川牛膝方組比較，△P<0.05

討 論

下肢難愈性創面屬中醫“潰瘍”、“臁瘡”范疇。早于唐醫書中即有記載，《華佗神醫秘傳·論癰瘡》云：“臁瘡有內、外之異，因臟腑中有濕毒，乃外發為瘡，亦有因打仆抓磕，或遇毒蟲惡犬咬破損傷，因而成瘡者。”中醫學對下肢難愈性皮膚潰瘍的治療歷史悠久，療效良好，歷代醫書都對此做過闡述，并在臨床經驗、方藥劑型的基礎上，發展形成理論，構成了獨特的理論體系。上海中醫藥大學附屬龍華醫院中醫外科，傳承顧氏外科，認為下肢難愈性皮膚潰瘍難以愈合的根本原因是“虛”,即正氣虛損[10]。我們認為下肢皮膚潰瘍創面“腐肉已脫”，肉芽色暗紅“新肉不生或難生”，經久難愈合；并且患者年高，多臟腑功能失調，正氣不足，故而膚失榮養。同時中醫“脾主肌肉”、“脾為氣血生化之源”、“脾主運化”的理論強調，全身肌肉都依靠脾胃運化的水谷精微化生氣血來營養，并促進創面肉芽組織生長，修復組織缺損[11]。因此在治療方面，尤其重視“益氣健脾”。在分期辨證論治的基礎上，將“益氣健脾”貫穿治療始終，治療不同階段側重略有不同。

四君子湯是健脾益氣的經典代表方劑。宋朝《太平惠民和劑局方》中記載了“四君子湯”，由人參、白術、茯苓、甘草四味藥物組成，該實驗研究以黨參代替人參。該方平和穩妥，遵從“君子致中和”的古意，故方名四君子。《醫方集解》云此方 “人參甘溫，大補元氣，為君。白術苦溫，燥脾補氣，為臣；茯苓甘淡，滲濕瀉熱，為佐。甘草甘平，和中益土，為使也。氣足脾運，飲食倍進，則余臟受蔭，而色澤身強矣。”自古牛膝作為引經藥，醫家認為其“引藥下行”，歷代本草均有論述。如《本草經疏》提出牛膝“性善下行”，并擅長 “病在下”疾患的治療。四君子加川牛膝方，以補虛生肌為治療原則，加川牛膝為引經藥以引藥下行，促使藥力直達病所，促進創面愈合。前期研究發現[12-13]，四君子湯加引經藥川牛膝，可提高創面的愈合速度，有效治療下肢皮膚潰瘍。

本實驗結果顯示，造模后第7天，創面肉芽組織HE染色，四君子湯組，成纖維細胞較多；生理鹽水組血管生成較少，成纖維細胞較少。與此同時造模后第7天，PDGF的表達，四君子湯組明顯高于生理鹽水組。

創面修復是將損傷組織結構的完整性進行修復和恢復的過程，包括了炎癥反應、細胞增殖和創面重建等幾個階段，主要包括：新生毛細血管生長、成纖維細胞增殖分裂、細胞外基質纖維化以及表皮細胞增生覆蓋創面[14]，最終完成再上皮化或者形成瘢痕。皮膚損傷，由于其存在嚴重的真皮缺損，需要先形成肉芽組織以填補缺損，這是整個創面修復過程中的最先環節，也是關鍵環節。而肉芽組織是由成纖維細胞與毛細血管共同組成的，因此成纖維細胞在創面修復中發揮重要的功能，其在創面愈合過程中起到遷移、增殖、分泌基質成份以及膠原纖維的作用，并且分泌多種細胞因子參與創面愈合。成纖維細胞與新生的毛細血管等共同構成肉芽組織，填補了組織缺損，為表皮細胞創造條件，促進創面愈合。因此成纖維細胞能否正常增殖，對促進創面愈合、維護機體功能，發揮了重要的作用。成纖維細胞的增殖能力成為反映其參與組織修復能力的重要指標。本次實驗結果表明，在造模后第7天，創面肉芽組織HE染色提示，四君子湯組，成纖維細胞較多；生理鹽水組血管生成較少，成纖維細胞較少。

PDGF是一種間接或直接的參與創面愈合的生長因子，參與細胞和組織的增殖與分化等過程，具有廣泛的生物學活性，在創面修復過程中起關鍵調控作用[15]。在創面修復過程中，創面或其周圍組織細胞可以通過旁分泌或者自分泌產生PDGF，而PDGF則可間接或者直接的參與組織及血管的修復，從而對創面的修復起調控作用。PDGF與細胞膜表面的受體結合后，可以通過受體的介導，激活細胞內MAPK信號轉導途徑，導致一系列連鎖反應。PDGF能促進成纖維細胞的增殖，并促進其分泌細胞外基質，在創面愈合過程中起關鍵調控作用。PDGF還可趨化單核細胞、中性粒細胞以及成纖維細胞，促使這些細胞遷移至創傷部位；PDGF 作為成纖維細胞的有絲分裂原，對成纖維細胞的再生具有誘導作用，能夠增加肉芽組織中成纖維細胞的含量；同時PDGF 在體內還可激活巨噬細胞，促使巨嗜細胞合成血管內皮生長因子，從而促進血管新生，加速創面愈合。

中醫認為下肢皮膚潰瘍存在“腐去肌生”、“肌平皮長”的愈合階段，與之相類似，西醫學認為創面的愈合，先后經歷“炎癥反應期”、“肉芽增生期”、“上皮形成期”過程。因此我們針對難愈性創面“腐肉已脫，新肉不生或難生”階段，依據中醫“補虛生肌”、“脾主肌肉”的理論，應用益氣健脾中藥四君子湯以促進肉芽組織生長，填充組織缺損，促進創面愈合。在造模后第7天創面以肉芽增生為主，補虛生肌類中藥四君子湯，通過上調PDGF等細胞因子的合成和分泌，PDGF通過趨化作用使單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等向損傷部位聚集，利于創傷早期炎癥消退；同時PDGF能促進成纖維細胞、血管內皮細胞的增殖與分化[13-14]，從而促進肉芽組織的生長，填充組織缺損；趨化角化細胞遷移，縮小創傷體積，并加速內皮細胞損傷修復，提高愈合速度。而造模后第14天，前期研究證實四君子湯組大鼠創面愈合平均時間為17.74 d，在造模后第14天，此時創面以“上皮化”為主，四君子湯益氣健脾促進肉芽增生作用起效甚微，故而對PDGF影響不大，與生理鹽水組比較無明顯差異。