香砂六君子湯對脾氣虛證淺表性胃炎大鼠線粒體能量代謝影響研究*

倪 菲,于 睿,崔家鵬,王彩霞,袁東超,楊茗茜,李思琦,曲金橋

1.遼寧中醫藥大學中醫學院(沈陽 110847)；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院西醫診斷教研室(沈陽 110032)

中醫理論認為脾為“后天之本，氣血生化之源”[1]，脾能化生人體的氣、血、精、津液，是由于脾從飲食中吸收營養物質，使其輸布于五臟六腑，四肢百骸，即“脾主運化”的功能。只有脾的運化功能正常，人體才能進行正常的物質生成與代謝。中醫的“脾”不僅是指西醫的整個消化系統，而且與多系統、多功能單位有關。琥珀酸脫氫酶(SDH)是線粒體能量代謝三羧酸循環中不可缺少的酶，它在生物體內可以起到催化琥珀酸脫氫從而轉變成延胡索酸的作用，并釋放出大量能量供機體使用。細胞色素氧化酶C(Cyt-C)，也被叫做呼吸鏈復合物，它位于呼吸鏈的末端，起到催化細胞色素氧化的作用，同時驅動其合成，是線粒體的標志酶，其酶活性的發揮對于維持各個部位線粒體結構和功能以及細胞能量的產生有非常重要的意義[2]。香砂六君子湯具有益氣健脾的功效[3]，本研究主要觀察香砂六君子湯對脾氣虛證淺表性胃炎模型大鼠胃竇細胞組織里琥珀酸脫氫酶活性及細胞色素氧化酶C含量的影響，旨在從線粒體能量代謝角度闡明其治療脾氣虛證淺表性胃炎的作用機制。

材料和方法

1 實驗動物 從遼寧長生生物技術股份有限公司購買SPF級2月齡雄性健康SD大鼠45只(體重200±20 g)，許可證號為：SCXK(遼)2015-0001。所有大鼠均在購買后進行分籠飼養1周，在不施加任何處理因素條件下給予自由飲水及飲食。動物飼養每天按時給予標準顆粒飼料。實驗觀察室采取開放形式，溫度、照明、噪音與換氣等自然飼養條件均嚴格控制在規定范圍內，每日定時進行清洗。

2 主要試劑 SDH試劑盒(批號：BC0955)與大鼠Cyt-C定量檢測試劑盒(批號：BC0854)，均購于北京索萊寶科技有限公司。脫氧膽酸鈉粉末、2%水楊酸鈉溶液與4%多聚甲醛溶液均購自上海金穗生物科技有限公司。

3 儀器及設備 主要儀器采用的是:全自動酶標儀anthos2010(由奧地利安圖公司生產)；UV-1801紫外/可見分光光度針(購自北京北分瑞利分析儀器公司)；臺式多功能冷凍高速離心機(Stratos，德國賽默飛公司生產)；勻漿器；精密數字電子天平(SETRA，美國)；可調式移液器；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；恒溫震蕩器(杭州奧盛儀器有限公司生產)、制冰機(SANYO公司生產)、水浴鍋等。

4 實驗方法

4.1 動物分組及模型制備：45只大鼠隨機分為正常組(健康組)15只(以下簡稱正常組)、脾氣虛證淺表性胃炎模型組15只(以下簡稱模型組)、脾氣虛證淺表性胃炎模型治療組15只(以下簡稱治療組)。正常組蒸餾水灌胃，每只1 ml/100 g, 2次/d，連續30 d；模型組采用勞倦過度與饑飽失常加強酸刺激等復合因素塑造脾氣虛證淺表性胃炎模型，第1～20天每隔5天，灌胃濃度為2%水楊酸鈉溶液，每次每只3 ml，并將20 mmol/L的脫氧膽酸鈉溶液當作飲料給大鼠們隨意飲用；而在第21～30天則分別將20 mmol/L的脫氧膽酸鈉2%和水楊酸鈉溶液當作飲料交替進行，每隔3天輪換1次，任意給大鼠們飲用，以加強刺激。與此同時，在第21～30天期間進行感染幽門螺桿菌。每次感染前先禁食14～16 h，經口腔緩慢灌注5%的NaHCO33 ml，15 min后灌注幽門螺桿菌菌液3 ml，40 min后給食。每隔5天感染1次，共進行2次。實驗第1～30天期間單日喂食甘藍。15～20 g/只，禁食，自由飲水；游泳至耐力極限(耐力極限系指大鼠游泳至口鼻部首次侵入水中)。雙日以豬油3 ml/只灌胃，自由進食、飲水。治療組造模方法同上，共造模30 d。

4.2 脾虛大鼠模型的評估標準：依據衛生部藥政司發布的《關于中藥治療脾虛證的臨床研究指導原則》中提到的診斷標準、1986年全國中西醫結合虛證老年病防治學術會議制定的“中醫虛證辨證參考標準”及《21世紀課程教材-中醫基礎理論》(李德新主編，2001年版)確定脾氣虛模型評估標準：①大便溏泄；②食少納呆；③消瘦，體重減輕；④神態萎靡，毛色無光澤；⑤蜷縮聚堆；⑥易疲勞。第①、②項為主癥，第③～⑥項為兼項，具備兩項主癥及兩項兼癥時，即可認為脾氣虛造模成功。

4.3 藥物干預：治療組30 d后，以香砂六君子湯(黨參20 g，茯苓、白術各15 g，清半夏、陳皮、砂仁、炙甘草各10 g，木香5 g，根據國家炮制標準炮制后，煎煮成湯劑，由遼寧中醫藥大學附屬醫院提供)灌胃，4℃保存，用前加熱至37℃。每公斤體質量大鼠的給藥量為人的6.3倍，并且每次給大鼠灌胃量為正常人給藥量的2倍劑量灌服[4]，早晚各1次，連續15 d。正常組和模型組灌服等量蒸餾水，方法同上。

5 指標檢測

5.1 琥珀酸脫氫酶(SDH)活性指標檢測：在實驗45 d后每組大鼠各留取10只，于給藥結束后立即處死取材備檢。檢測前各組大鼠禁食16 h，采取吸入式麻醉后剖開腹腔，迅速剪取距幽門近端約2～3 cm的胃竇組織。各稱取1 g放入預冷的蒸餾水中洗去血液后，準確稱量0.1 g胃竇組織加9倍生理鹽水后，用冰浴勻漿器充分研磨后制成10%的勻漿，4℃11000 g離心10 min后，按照試劑盒明確注明的方法提取上清液放置冰上進行SDH活性檢測。

5.2 細胞色素氧化酶C(Cyt-C)含量檢測：采取吸入麻醉后，剖開大鼠腹腔，剪取距幽門近端約2～3 cm的胃竇組織，各稱取1 g放入預冷的蒸餾水中洗去血液后，加入一定量的PBS(pH7.4)。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2～8℃的溫度。在加入一定量的PBS之后(pH7.4)，用勻漿器將標本進行充分的勻漿處理。以2000～3000 r/min的速度離心20 min左右后注意仔細收集上清液按試劑盒說明方法進行細胞色素氧化酶C含量檢測。

5.3 胃竇組織HE染色普通光鏡下觀察病理：大鼠吸入麻醉后，剖腹切取損傷嚴重的胃竇組織1 cm3,沿大鼠胃大彎處剪幵，平鋪，置入裝有生理鹽水的燒杯中洗滌2次，后用水沖洗干凈，切塊，投入4%多聚甲醛中固定24 h，20%和30%蔗糖梯度脫水，冰凍，切片，進行常規HE染色，封片，于不同倍數光鏡下觀察胃黏膜改變。

結 果

1 脾氣虛大鼠模型建立的指標觀察 脾氣虛造模大鼠，造模第5天開始，喂藥當日就會出現軟便，次日自行恢復。隨著造模時間延長，喂藥當日則會出現溏便，次日可以見到軟便。自造模15 d左右逐漸形成蜷縮聚堆，拱背，萎靡，毛發枯槁，納呆、怠惰，便溏，個別有黏液便，體重減輕，出現了脾氣虛證。22 d以后可見溏便臟尾，懶動，毛枯槁無光澤，進食減少，泄瀉，拱背，體重增長緩慢，以上表現持續至造模結束。本實驗研究中脾氣虛組動物出現各體征及表現與臨床脾氣虛證具有一定的相似性。正常組大鼠則毛色潤澤，進食量大，體重呈自然上升趨勢，上述脾氣虛癥狀未出現。說明本實驗成功復制了脾氣虛證大鼠模型。

2 脾虛淺表性胃炎大鼠病理組織學觀察 正常組大鼠胃竇組織黏膜上皮細胞排列整齊，細胞呈單柱狀，腺體排列緊密規則，極少見到炎癥細胞浸潤；模型組胃黏膜上皮細胞受損，表現為排列紊亂，黏膜層可以觀察到有大量炎癥細胞浸潤，部分能看到有成堆的淋巴細胞聚集灶，而胃竇黏膜腺體則表現為排列紊亂；治療組大鼠胃黏膜的表面上皮細胞受損和炎癥細胞浸潤情況與模型組相比明顯減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠胃竇組織黏膜(HE染色，×100)

3 各組大鼠琥珀酸脫氫酶活性的比較 見表1。三組大鼠于45 d后處死，進行檢測，測定胃竇組織的琥珀酸脫氫酶活性，從表1結果可見，模型組大鼠琥珀酸脫氫酶活性顯著低于正常組和治療組，差異具有統計學意義(P<0.05)，治療組琥珀酸脫氫酶活性顯著高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)，治療組與正常組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 大鼠胃竇組織琥珀酸脫氫酶活性比較(U/mgprot)

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05

4 各組大鼠細胞色素氧化酶含量的比較 見表2。從表2結果可見，模型組大鼠細胞色素氧化酶含量顯著低于正常組和治療組，差異具有統計學意義(P<0.05)，治療組細胞色素氧化酶含量顯著高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)，治療組與正常組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 大鼠胃竇組織細胞色素氧化酶含量比較(nmol/L)

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05

討 論

慢性淺表性胃炎，又稱慢性非萎縮性胃炎，是一種由多種病因引起的胃黏膜的慢性淺表性炎癥[6]，主要臨床癥狀表現為上腹脹痛、灼熱感、噯氣、反酸、食欲減退等。屬于中醫“胃脘痛”范疇[7]。其發病與多種因素有關，如幽門螺桿菌(HP)感染、免疫因素、辛辣刺激飲食、藥物等，并且慢性淺表性胃炎發病時間長后極易發展成為慢性萎縮性胃炎[8]。西醫主要采取根除幽門螺桿菌感染、保護胃黏膜、抑制胃酸分泌、促進胃腸動力等方法治療。香砂六君子湯出自《古今名醫方論》，由四君子湯加半夏、陳皮、木香、砂仁而成[9]，具有補氣理胃，行氣化滯之功，同時也是臨床治療脾胃虛弱，氣機阻滯而變生胃痞的有效方劑[10]，屬補益劑范疇。目前臨床廣泛用于消化性潰瘍、漫性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎及功能性消化不良等[11]。方中黨參補脾胃之氣；白術健運脾胃以助消化；半夏與陳皮降氣化痰；木香辛散溫通，化滯助運；砂仁理氣和胃止嘔[12]。

如果從現代醫學角度來進行分析，胃腸道中消化液的分泌，小腸對各類營養物質的吸收及胃腸平滑肌的自身運動均需要耗費能量，而這些所需能量則主要是由線粒體對食物的氧化提供。人體全身的組織細胞當中幾乎都存在著線粒體，線粒體是生物體內細胞對食物進行生物氧化作用，進而不斷產生能量的重要細胞器，因此它又被稱為“ATP的生產基地”、或是“細胞的動力站”。它在人體能量代謝系統中占有重要地位[13],這與中醫脾為“氣血生化之源”、“后天之本”的說法密切相關[14]。琥珀酸脫氫酶是線粒體的一種標志酶，位于線粒體內膜上的一種與內膜相結合的酶，是連接呼吸電子之間傳遞和進行氧化磷酸化的樞紐之一。除此之外，它還可以為多種原核細胞產生能量的呼吸鏈提供電子。由此我們可以說，SDH的活性增高也就代表著細胞內的能量即ATP生成也隨之增強[15]。細胞色素氧化酶，也被叫做呼吸鏈復合物，它位于呼吸鏈的末端，起到催化細胞色素氧化的作用，同時驅動其合成，也是線粒體的標志酶，其酶活性的發揮對于維持各個部位線粒體結構和功能以及細胞能量的產生有非常重要的意義和作用。脾主運化的功能正常，則可以從飲食水谷中攝取精微以營養五臟六腑、四肢百骸，而各類營養物質的吸收，就是一個主動消耗能量、不斷消耗ATP的過程。由此可以得出的結論是，脾主運化功能的強弱與琥珀酸脫氫酶的活性與細胞色素氧化酶C的含量密切相關。

實驗開始時，各組小鼠的體質量并無明顯差異，糞便質地、數量均正常。除正常組(健康組)外，其余各組小鼠于造模第8天開始就逐漸出現飲食量下降，毛發不光澤且稀疏，大便稀軟粘膩，肛周不潔，活動頻率下降等表現。說明慢性淺表性胃炎在一定程度上可以引起身體消瘦，食欲不振的癥狀。本實驗結果顯示，香砂六君子湯可以顯著提高脾氣虛證淺表性胃炎大鼠胃竇組織琥珀酸脫氫酶的活性及細胞色素氧化酶C的含量，從而增強胃竇細胞線粒體的氧化供能作用，說明香砂六君子湯作為益氣和胃，行氣化滯之良方，具有較好的治療淺表性胃炎的作用，其作用機制可能是通過提高胃竇細胞線粒體細胞色素氧化酶的含量及琥珀酸脫氫酶的活性實現的。